Tümör başlatıcı kanser kök hücreleri (CSC’ler), kendini yenileyebilen ve heterojen pluripotent kök hücre popülasyonu üreten neoplastik hücrelerdir. Düzenli tedavilerden korunma ve malign büyümenin tamamen yok edilmesindeki güçsüzlük nedeniyle durağan ve seyir halindeki CSC’lerin keşfi, tümör metastazı ve hastalık tekrarı tehlikesinde aşamalı olarak başarılı bir azalma amacıyla yeni yardımcı sistemler oluşturmak için temeldir. Bu bölüm; tümörijenite ve kendini yenileme ile ilgili yollar ve farklı malign büyümelerde histolojik tümörün iyileşme yeteneği gibi CSC’lerin özelliklerinin yanı sıra keşif ve ayırma, yan popülasyon, hücre belirteçleri ve CSC kültürünün oluşturulması için çeşitli stratejiler hakkında bilgiler içermektedir.
Kanser kök hücreleri, hücresel belirteçler, kendini yenileme, yan popülasyon, tümörijenite
Kanser kök hücrelerinin kötü huylu büyümesi, kanserin birincil sebebi olarak önerilmiştir. Bir tümör popülasyonunda kanser kök hücrelerinin varlığının hipotezi, ilk olarak Bonnet ve arkadaşları tarafından ileri sürülmüştür. Lösemide, dolaşım sisteminin olgunlaşmamış mikroorganizmalarıyla karşılaştırmalı özelliklere sahip küçük bir klonlama hücre popülasyonu ayırt ettiler. CSC’ler; orta hücre döngülerine sahip hareketli tümör hücreleridir, kendi kendini yenileme kapasitesine sahiptir (sınırsız hücre bölünmesi ve farklılaşmamış hücre havuzunu korur) ve ayrı tümör prognozuna (tümorijenisite) sahiptir. Bu hücreler, bir tümör içindeki kötü huylu hücrelerin birkaç seviyesini oluşturur, genelde %0.01-1.0 [1]. Meme, kolon, yumurtalık, akciğer ve baş ve boyun karsinomları ve ayrıca birkaç diğer tümör; kanser kök hücreleri içerir [2]. CSC’ler, kemoterapiden sonra tümör büyümesine karşı ve ayrıca damarlara ve komşu organlara tümör girişine karşı vücudu korumaktan sorumludur . CSC’lerin başlangıç noktası, şimdiye kadar tartışmalı bir konu olarak kalmıştır [3]. CSC’lerin başlangıç noktası ile alakalı başlıca üç tahmin ortaya atılmıştır: karakteristik farklılaşmamış kök hücrelerin düzenlenmesi, büyümüş ancak gelişmemiş hücrelerin epitelyalden mezenkimale geçiş yoluyla pluripotent malign hücrelere geçişi [4]. CSC’lerin önemli noktaları göz önüne alındığında, obstrüksiyonu olağanüstü derecede yatıştırırlar, rahatsız edici ve metastatik kapasiteye ve tümörijeniteye sahiptirler ve kendi kendini yenileyebilirler. CSC’ler, bu hücreleri tümör kütlesindeki farklı hücrelerden ayıran özelliklere bağlı olarak başlıca iki kaynaktan ayrılır: kötü huylu büyüme hücre dizileri ve tümör dokuları. Büyümüş kötü huylu hücre hatları, CSC ayırma ve izolasyonu için yaygın olarak uygulanır [5,6]. Hücrelerin alt kültürlenmesi yoluyla meydana gelen kültür ayarlaması ve kalıtsal modifikasyonların bir sonucu olarak, birincil CSC’lerin biyolojik özellikleri hiperoksik koşullar altında ifade edilemez [7]. Tümör dokularından bu tür temel hücre dizilerini üretmek için güçlü sistemlerin uygulanması, araştırmaları ilerletmek için önemli yöntemler sağlayabilir [6, 8-18]. Mevcut biyolojik belirteçlerdeki gelişme ile bu hücre dizisini çeşitli ilaçlarla kullanarak CSC ile ilişkili yolakları hedeflemek kolaydır [9,19]. Bu kötü huylu kök hücreleri ayırmak için çeşitli stratejiler kullanılmaktadır. Bazıları hücre yüzeyi işaretleyicilerinin kullanımına bağlı olarak kurulur. Varsayılan yüzey belirteçlerini kullanan bu CSC’lerin izolasyonu ve ayrılması, kanserde bir araştırma ihtiyacı olmuştur. Diğer stratejiler çoğunlukla CSC’lerin işlevsel yönlerine dayanır [10-14]. Bu bölüm, CSC’lerin izolasyonu ve tanımlanması için güncel yaklaşımlar sağlayacaktır.
CSC’ler, tipik dokuları gibi elde edilen niteliklere sahip olabilen güçlü hücrelerdir. Artan telomeraz ve glutatyon sentetaz aktiviteli ABC taşıyıcı akışı, tipik CSC’lerin antikanser terapötiklerine girdikten sonra bile hücre dayanıklılığını ve çoğalmasını dikkate alan yavrularına [20-25] kopyalanan belirgin bir özelliğidir. Örneğin, bazı gastrointestinal hastalık hücre dizileri; azaltılmış glutatyonun -duyarlı oksijen türlerinin dengesine dahil edilen önemli bir parçacık- genişletilmiş kombinasyonunu ortaya çıkaran CD44 ve hücre yüzeyi sistein-glutamat taşıyıcıları arasındaki iletişim aracılığıyla oksitleyici basınca karşı gelişmiş koruma gösterir [15]. CSC’ler, kemoterapötik ajanların ve ayrıca diğer antikanser ilaçların ilaç atılımında yer alan gelişmiş ABC taşıyıcıları [28] ile birlikte metabolik yeniden programlama ve ayrıca [16,26] DNA hasarının hızlı onarımında [17,27] yer alır. Bu hücrelerin küçük bir kısmı bile, anti kanser tedavisini atlatır ve tüm tümörün iyileşmesine yol açan bir tümör kitlesi nüksü olsa bile tespit edilmeden kalır[29,30]. Kurtova ve arkadaşları; çoğalma için apoptozun, prostaglandin E2’yi boşaltan ve mesanede uyku halindeki keratin 14+ CSC’leri harekete geçiren belirli kemoterapötik ilaçlar yoluyla sağlıklı hücrelerde aktive olduğunu keşfetti [31]. Eksik tedaviden sonra bulunan CSC’nin aşırı agresif doğasının üstesinden gelmek, yeni terapötiklerin geliştirilmesi için öncelikli bir ihtiyaçtır.
CSC’leri tespit etmek için geliştirilen özgül veya duyarlı biyobelirteç yoktur. Tablo 3.1, çeşitli kanserlerde CSC’leri ve bunlara karşılık gelen belirteçleri gösterir.
CSC’ler, birkaç protein çıkışı ile karakterize edilir. Türlü hücre yüzey belirteçleri, çeşitli hastalıklarda CSC’lerin tanımlanması ve hedeflenmesi için önemli bir rakip olarak hareket eder. Bu belirteçlerin artikülasyon tasarımları ve artikülasyon dereceleri çeşitli tümör kütleleri arasında dalgalanır; her durumda, hiçbir kusursuz belirteç sunulmamıştır. Kötü huylu büyüme incelemesinde, proteinler gibi CSC alt kümelerinin belirteçleri genellikle CSC popülasyonunu karışık hücre popülasyonundan ayırmak için bir profil kurmak amacıyla kullanılır. [51] Bu belirteçler genellikle katman proteinlerinin karakterizasyonunda bir yere sahiptir. [52] CSC’leri tanımak ve birbirinden ayırmak için, uygun CSC yüzey belirteçlerinin seçilmesi temel bir ihtiyaçtır. Bu noktada, bu belirteçler; potansiyel CSC’leri, floresanla başlatılan hücre düzenleme (FACS) veya çekici etkinleştirilmiş hücre düzenleme (MACS) prosedürleriyle ayırmak için kullanılır. [53] Çeşitli yüzey belirteçleri, örneğin prominin-1 (diğer adıyla
CD133), CD24, CD16, CD13, CD44, CD38, CD34, epitelyal belirgin antijen (EpCAM/ESA), CD20, CD176 ve CD66c; yalnız veya kombinasyon halinde, çeşitli kötü huylu hastalıklarda CSC dağılımını sınıflamak için kullanılmıştır [54]. Sıradan farklılaşmamış hücreler (SC’ler, örneğin embriyonik kök hücreler ESC’ler) ve yetişkin kök hücreler (ASC’ler) üzerinde tanınan CSC düzenlemesi için uygulanan çok sayıda yüzey reseptörü gözlemsel olarak ayırt edilmiştir [54]. Ek olarak, tümör dokusunun tek bir hücre süspansiyonu halinde ayrılması, yüzeyde antijenin yetersiz kalmasına ve CSC ayrılmasının üretkenliğinin azalmasına neden olabilir[55]. Ayrıca, protein tedavisi ve formların düzenlenmesi sonrasında hücreler kullanılamaz hale gelebilir. Tümörijenik hücrelerin %1-3’ünün tümörijenik olmayan popülasyonu zayıflatması, hücrenin kendini düzenlemesinin yanlış bir teknik olduğunu doğruladı [56]. Güçlü tekniklerden biri, tümör dokularından hücrelerin mono süspansiyonunu takiben immünizer bazlı akış sitometrik ölçümünün oluşturulması yoludur. Farklı tekniklerle bağlantılı olarak, hücre belirteçlerine bağlı ayırma, yan popülasyon (SP) ölçümünden ve sferoidlerin geliştirilmesinden daha kesindir; her ne kadar öyle olsa da, protein parçalayıcı bileşiklerin kullanıldığı test işlemi sırasında yüzey işaretleyicilerinin olası zararları ve önceden belirlenmiş sayıda ayrılmış hücre dahil olmak üzere birkaç dezavantaj vardır. Sınırlandırılmış hücrelerin düşük uygulanabilirliğinin yanı sıra maliyetli, karmaşık ve sıkıcı kullanımı; bu tekniğin kullanımı için sınırlayıcı bir faktör olan, CSC’lerin yüzey işaretleyici bağımlı ayrımının bir sıkıntısıdır [57-63]. CSC belirteçlerinin kullanımı, hastalık tahmininde ünlüdür. Yetersiz ayrılmış tümörlerin çoğu, kötü huylu büyümelerinde meme CSC’lerinin en dikkate değer ağırlığına sahiptir [61]. Ek olarak, kolon kötü huylu büyümesinde CD133 artikülasyonu, karaciğer metastazına bağlı zayıf görüntülemenin bir belirtecidir [64-66]. Pankreas kanserinde prognozun antagonistik bir belirteci olan yükseltilmiş CD133, lenf merkezi atağı ile ilişkilidir [67,68]. CD133 artikülasyonu, yumurtalık hastalığında zayıf klinik sonuç ile ilişkilidir [69]. Ek olarak, CD44 aşırı artikülasyonu pankreas kanseri hastalarında kötü prognoz ile bağlantılıydı [71-73].
MACS tekniği, boyama olmadan kök hücrelerin izolasyonuna ve zenginleştirilmesine olanak verir. Antikorlar ile manyetik nanomateryallere bağlanan ve etiketlenen hücreler, oldukça uyumlu bir manyetik alan bölümü üzerinde iletilir. Tüm bu prosedür boyunca, antijen eksprese eden hücreler, manyetik noktalara çekilir ve kolona bağlı kalır, ancak antijen için negatif çeşitli hücreler kolondan düşer [74]. Sonuç olarak, ilgili hücreler, hücrenin çeşitli popülasyonlarından kolondan ayrıştırılacaktır. Bu yöntem, hücre süspansiyonu gerektiren parametre ayrımına dayanır. Bununla birlikte MACS, tümör kitle hücrelerinin küçük popülasyonunu izole etme yeteneği ile CSC ayrılmasında basit bir stratejidir [75-77].
FACS, immün boyama yoluyla spesifik yüzey proteinlerine veya hücre içi yüzey belirteçlerine odaklanan floresan etiketli belirteçler kullanarak hücreleri ayırabilen başka bir hücre hapsetme tekniğidir. Bu strateji, bir hücresel numunenin veya süspansiyon içindeki parçacıkların sınırlı bir sıvı akışı yoluyla izole edilmesine izin verir. Numune bir lazerden geçerken, tek tek hücrelerin/parçacıkların taneciklilik, boyut ve floresan özelliklerinin tanınmasını sağlar [78]. Çoğunlukla, FACS ayırma; çeşitli yayılma dalga boylarına sahip gerekli veya opsiyonel antikorlarla doğrudan konjuge edilmiş florokromları kullanır. Numunenin büyük bir bölümü kaybolabileceğinden, FACS genellikle daha fazla hücre gerektirir. Çoğu durumda, biyopsi testi için veya hasta kanında mevcut olan toplam CSC sayısı aşırı derecede düşük olabilir. Bu yüzden, CSC’leri yaygın olmayan bir örnekten geliştirmek için giderek daha etkili bir prosedür gereklidir. FACS, MACS’den farklı olarak çok parametreli bir stratejidir. MACS, FACS’den daha az zor olmasına ve daha az karmaşık araç gerektirmesine rağmen; monoparametriktir ve aynı anda çok sayıda belirteç aracılığıyla hücreleri izole edemez [79,80]. Ek olarak, FACS tarafından CSC’nin ayrılmasının yeterliliği de oldukça tatmin edicidir.
CSC’ler; kendini yeniden kurma, sakinlik, eşit olmayan hücre bölünmesi, yavaş çoğalma fenotipi, yüksek ABC taşıyıcı artikülasyonu, aldehit dehidrojenaz 1 (ALDH1) etkisi ve birçok kötücül büyümede azalmış mitokondriyal etki dahil olmak üzere bazı doğal özelliklere sahiptir. Bu yararlı özellikler, üretken CSC ayrılmasına izin vermek ve Şekil 3.1’de gösterildiği gibi tanınabilir kanıt yöntemleri oluşturmak için kullanılır.
Kanser ilacının in vitro olarak taranması, genellikle, insan vücudundaki tümörün 3D mikro ortamını kopyalayamayan 2D hücre kültürü modeli ile yapılır; örneğin, hücre ve hücre dışı matriks (ECM) arasındaki hücresel etkileşimler ve diğer matriks etkileşimleri, doku belirgin mühendisliği ve doku belirgin kapasiteleri için temel olan çeşitli diğer işaretler. Bu sorunlar, tümör dokusu özelliklerinin 3D doku kültürleri üzerinde kopyalanmasıyla aşılmıştır. Metabolik sferik kültür durumu, kültürün katmanlarında, yani hipoksi ile iç katmanda ve nekrotik hücrelerle asidik koşullarda, sessiz hücreleri içeren ara katmanda ve aşırı oksijen ve diğer besinlerin varlığı nedeniyle yüksek çoğalma hücreli dış katmanda gelişimsel değişikliklere uğramıştır [81]. Matriks proteinlerinin oluşumunun ve ifadesinin, iki boyutlu kültürden zıt olarak sferoidlerde daha yüksek olduğu gösterilmiştir [68,82,83]. Tümörde çeşitli hücre türleri ile kötü huylu büyüme hücrelerinin sferoid birlikte kültürleme yeteneği, hücre-hücre bağlantısı ve gelişim faktörleri yoluyla hücreden hücreye ilişkilendirmeyi genişletti [69,70]. Bu özellikler, sferoid geliştirme testini belki de on yıllar önce en yeni antikanser ilaçlarının değerlendirilmesi için en iyi yarışmacı yapar.
Şekil 3.1 CSC’leri tanımlamak için fonksiyonel testler.
Kültür tekniklerine bağlı dört ana dairesel kötü huylu büyüme modeli oluşturulmuştur: çoklu hücreli tümör sferoidleri, tümör çemberleri, doku tarafından belirlenen tümör çemberleri ve organotipik çok hücreli sferoid modelleri. Çoklu hücreli sferoidler; mono hastalıklı hücresel sferoidlerin tamamı ya da multitipik sferoidler veya 3D kültürde çerçevelerde geliştirilen gömülü hücreler olarak adlandırılan malign hücrelerin diğer hücre tipleriyle birlikte kültürlenmesi ile karakterizedir. Hücre tipine ve daire yaşı tekniklerine bağlı olan daire boyutu, 100 μm’nin altında ve 3 mm genişliğinde, 200-500 μm arasında gelişmiş bir boyut arasında dalgalanabilir. Tek hücreli süspansiyon kültürü, fetal sığır serumu (FBS) görüş alanı içinde ve harici matris proteini olmadan sferoidler oluşturmak için kullanılır [84]. Şu anda; asılı damla, döndürücü kaplar, sıvı kaplama ve selüloz bazlı mikropartiküller dahil olmak üzere sferoid oluşturmak için birkaç çok hücreli tümör sferoidi (MCTS) stratejisine erişilebilir. Sferoid tümör muayenesinde test edilecek tümör doku örneği, bileşik veya mekanik güç ile mono hücre süspansiyonuna ayrılır. Mono hücre süspansiyonundan trombositler daha sonraki işlemler için çıkarılır. Bundan sonra; hücre süspansiyonu, hücrelerin gelişimi için epidermal büyüme faktörü (EGF) ve daha az miktarda bazik fibroblast büyüme faktörü (b-FGF) dahil edilerek güçlendirilen serumsuz ortamda kültürlenir. Tüm bu koşullar, hücrelerin klonal yuvarlak gruplar halinde büyümesi için gereklidir [48,49,85]. Tümör küresi bilimi dikkate değer olmamasına rağmen, tümör küre modelinin in vivo tümör yapısını ve mikro ortamı tam olarak taklit etmediği belirtilmiştir. Doku tarafından belirlenen tümör çemberlerinden (TDTS’ler) ziyade organotipik çok hücreli sferoidlerin yaşı, ayrılma aşamasına sahip değildir. 0,3-0,8 mm genişliğinde parçalara ayırmanın ardından tümör dokusu, %10 FBS ve bol bol amino asitlerle zenginleştirilmiş kalıplanmış ortamda %0,75 agar ile kaplanmış doku kültürü kaplarında rafine edilir. Glioma sferoidlerinin dondurularak saklanmasından sonra histolojik özelliklerinin sabit kaldığı ve buzu eritme sonrasında sadece küçük genotipik ve fenotipik değişikliklerin görüldüğü belirtilmiştir. Güçlü tümörden kök ve ata hücrelerin fark edilebilir kanıtı, işlevsel bir tek hücre süspansiyonu elde etmek için dikkate değer zorluklar sunar. Olgunlaşmamış mikroorganizmalar düzenli olarak oldukça nadir görülen güçlü bir tümörün popülasyonu olduğundan, sonucu artırmak için her hapsetme girişimini geliştirmek esastır [71-75].
Koloni oluşum testi, en az 50 hücreden oluşan bir kolonideki hücrenin klonal gelişim yoluyla kendini yenileme sınırını ölçen in vitro kantitatif bir stratejidir [76]. Bu test, iki boyutlu bir kültürde yapışık hücreleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan CSC’lerin tanınmasını sağlayan bir stratejidir [77]. Klonojenik kapasiteyi değerlendirmek için CSC’lerden türetilen koloniler, tek hücre halinde 21 gün boyunca yumuşak bir agar içinde inkübe edilir ve kristal viyole veya nitro-mavi tetrazolyum (NTB) ile boyanır. Elde edilen tüm CSC kolonileri izole edilir ve CSC olmayan hücrelerden elde edilen kolonilerden ayrılır. CSC’lerden türetilen koloniler, CSC olmayan hücrelerden türetilen kolonilerden daha büyük bir boyuta sahiptir. Pek çok teknik değişiklik klonojenik testi etkileyebilir. Sıcaklık hücreleri öldürmeyecek kadar düşük, aynı zamanda kuyuları doldurmak için yeterince yüksek olduğunda, otoklavlanmış ortam seyreltilmiş hücreler içermelidir; uygun seyreltme, her koloninin tek bir hücreden kaynaklandığını doğrulamak için önemlidir; ek olarak, agarın hücreler üzerindeki toksisitesi dikkate alınmalıdır, aksi takdirde sonucu etkileyebilir. CSC’lerin klonal halkaları yapılandırdığı bileşen genellikle belirsiz olmasına rağmen araştırma, tümör hücrelerinden kendi kendini yenileyen popülasyonu belirleyebilmek için serumsuz bir süspansiyon üzerinde yapılır [78-81].
Tümorijenisite, biyolojide terapötik olarak yanıt veren CSC’lerin tanınması için en etkili ve popüler altın standart yöntemdir [75-77]. Sınırlayıcı seyreltme testi (LDA), dinamik CSC nüksünün değerlendirilmesi için normal olarak kullanılan en iyi tümörijenisite stratejisidir [82, 86]. Bu testte, aşırı sınırlayıcı seyreltme analizi (ELDA) programından yararlanılır; %0-100 reaksiyonlu alt popülasyonları kaydetmek için kullanılabilir [83]. Her durumda bu stratejinin yan etkileri, hücresel miktar, hücre taşıyıcısı, inkübasyon ve implantasyon yeri ve zamanına göre değişkenlik gösterebilir [86]. Bu teknikte yüksek verimli tarama kullanılamaz [87-90]. Damar sistemi, insan CSC gelişiminin kontrolörü olduğu için sıçanlarda CSC çalışması üzerindeki mikro-çevre etkilerini incelemek zordur [83, 86, 87].
PKH26 ve PKH6, hücre bölünmesinden sonra benzer yavru hücreleri ayıran boyaları bağlayan lipofilik floresan hücre zarıdır. Normal hızda bölünen bir hücrede boya etkili bir şekilde tutulabilirken, hızla bölünen hücrelerin zarında boyada anlık bir seyrelme vardır. PKH26 aracılığıyla boya etiketleme tekniği, CSC’leri ayırt etmek için kullanılmıştır. Bu etiketler, yavru hücreler oluşturmak için daha uzun sürede asimetrik bölünen CSC’lerde kalır. Osteosarkom ve meme kanseri CSC’leri bu yöntem kullanılarak ayrılır [91, 92]. Bromodeoksiüridin (BrdU) etiketlemesi, benzer bir etiketleme yaklaşımına bağlıdır. Farklılaşmış hücrelerle karşılaştırıldığında, CSC’ler bölünen hücrelerden daha fazla BrdU tutar [93]. Karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) boyası da birkaç katı tümörde hücre bölünmesi tekrarını takip etmek için kullanılmıştır. Güncel incelemeler, CFSE etiketlemesinin, glioblastomlardan orta hızda bölünen hücreleri tanımak ve sınırlamak için kullanılabileceğini keşfetti [93-99]. Serebral tümör patolojisi, hücrelerin boya tutma özellikleri nedeniyle bu boyalar aracılığıyla başarılı bir şekilde incelenebilir [96-98].
Sitozolik orijinli bu izoenzimler, hücre içi aldehitin oksidasyonu ile ilgilidir [100]. ALDH izoformları insanda 19 farklı şekilde bulunur. ALDH1, malign transformasyon sırasında retinolün retinoik aside dönüşümünü katalize eder ve ayrıca bu malign kök hücrelerin proliferasyonunu ve farklılaşmasını etkiler [101–103]. ALDH1 enzimi ayrıca Akt sinyal yolunun aktivasyonuyla Wnt/β-katenin yolunu harekete geçirir. Ayrıca CD44 ekspresyonu, ALDH1’in aşırı ekspresyonuyla normal hücreleri kemoterapiden koruyan ALDH1 ile ilişkilidir. Hücrelerin başlangıcından itibaren, olgunlaşmamış kök hücreler, potansiyel uygulamalarla rejeneratif tıp için ALDH1 kullanılarak ayrılabilir. CSC’lerden gelen proteinler, sitozolik ALDH1 hareketi nedeniyle çeşitli katı tümörlerde güvenilir belirteçler olarak işlev görür. Yüksek ALDH1 seviyelerine sahip hücreler, ALDEFLUOR testi veya FACS incelemesi kullanılarak ayırt edilebilir [104]. Bu iki stratejiyi kullanan ALDH1-pozitif hücrelerin, negatif ALDH1 hücrelerine göre genişletilmiş küresel düzenleme yeteneği, kendi kendini yeniden oluşturma özellikleri, tümörijenite ve yüksek gövde nitelikleri olduğu gösterildi [105]. ALDEFLUOR testinin tepkime ürünü, ALDH hareketi ile ilişkili farklılaşmamış hücrelerde toplanır [106-109]. Bu toplanma sonucu, canlı hücrelerin ALDH substratı BAAA’nın (BODIPY-aminoasetaldehit) floresan ürünü BAA’ya (BODIPY-amino asetik asit türevi) dönüşmesine izin verir. Hücrelerin içindeki önemli ALDH1 seviyeleri muhteşem bir şekilde floresan hale gelir ve akım sitometrisi tarafından tanınır [110]. ALDH1’e özgü substrat, ALDEFLUOR tarafından CSC’lerin tanınması için spesifik bir bağışıklık reaksiyonu oluşturarak tepkimeye katılır. ALDEFLUOR testi epitelyal tümör CSC’lerini belirler [111–113]. Bu testin uygulanmasına engel olan, araşırılan osteosarkom ALDH1-pozitif hücrelerinin, küre şekilini alırken, hücre popülasyonunun rahatsız edici bir şekilde artmasıdır. [93, 103]. Çeşitli tümörlerin zayıf prognozu, ALDH1’in artan ekspresyonu ile ilişkilidir [83].
Tepki, bir substratın işlevsel hücrelerde tutulan floresan ürüne dönüştürülmesini içerir. Parlak floresan ve yüksek ALDH içeren hücreler akım sitometrisi ile ayırt edilir veya daha fazla saflaştırma için hücre regülasyonuyla iyileştirilir [110]. Klinik örneklerde [111] ALDH1 reaksiyonu için substrat, CSC’lerin tanınması için ALDH1’e özgü bir antikorun kullanılabileceği ALDEFLUOR reaktifi tarafından sağlanır. ALDH1, karaciğer ve pankreas gibi, tüm tümör tipleri için uygun bir CSC belirteci olmayabilir [112, 113]. Bu yöntemde görülen bir diğer engel, daire çerçeveleme bölümünde gelişmiş ve ilerleyici bir popülasyonla ilişkili kemik kanseri ALDH1-pozitif hücrelerde sergilenmiştir [32-34]. Tümöre açık bir fenotipin yokluğu, CSC’lerin tanınmasında sorun yaratmıştır [84, 93]. SP ayrımı, farklılaşmamış hücreleri ve çeşitli malign büyümeleri tanımak için umut verici bir stratejidir. Yan popülasyon tahlili için fare kemik iliği hücreleri FACS kullanılarak ölçülmüştür. Bu strateji, CSC’lerin Hoechst 33342 ve Rh123 gibi organik DNA bağlayıcı boyamalarla ayırt edilmesini. Bu, hücre içinde yer alan ABC taşıyıcıları ve çoklu ilaç direnci (MDR) mekanizması ile sağlanır. Bu popülasyonun içindeki hücreler, akım sitometrisi tepe grafiğindeki alanları nedeniyle “SP” olarak adlandırılmıştır. Kök hücrelerde ABC çoklu ilaç akış taşıyıcılarının çıkışı, sitotoksik maddelere karşı hayati bir savunma bileşeni olarak artırılır. Bu ailede temel bireyler, çeşitli tümörlerde yukarı regüle edilen ABCB1 (Çoklu İlaç Direnci-1, MDR1), ABCC1, ABCF2, ABCB2, ABCC7, ABCG2 ve ABCA5’tir. SP hücreleri, onları diğer hücre popülasyonlarından ayıran bazı belirgin özelliklere sahiptir. Hem SP kısmında hem de SP olmayan kısımda, ayrılacak miktarı oluşturmak için bölünerek yaşama kapasitesi ile tekrar tekrar tümör oluşumunu başlatabilirler. Bu hücreler klonojenik limit, tümörijenite, multipotens ve kemorezistansa sahiptir [14]. SP testi yoluyla kök hücrelerin tanınması ve sınırlandırılması, heterojen örnekler içinde yaygın olmayan SP bölümlerinin (mutlak hücre popülasyonunun <%0,5’i) tam olarak keşfedilmesini sağlayan ABC taşıyıcılarına karşı antikorlarla yapılan sıradan immün boyama ölçümünden daha üstün hedeflere sahiptir. Ek olarak, hücrelerin farklı DNA kısıtlayıcı boyalar kullanılarak in vitro ve in vivo ortamda doğru olarak tanımlanabilmesi zahmetlidir; bununla birlikte, uygun hücreler üzerinde gerçekleştirilen SP testi, hücre popülasyonunu tanımlamak için daha basit ve güvenilir bir strateji sağlar [103].
Kök hücre izolasyonu, Hoechst SP tahlil stratejisine dayanır. Floresan Hoechst boyası, nükleik asitlerin AT bakımından zengin bölgelerine, özellikle DNA’nın küçük oluğuna bağlanır. Canlı hücrelerde plazma membranına, Hoechst boyaması yoluyla da erişilebilir [73]. Uyarılma üzerine, 405 nm’de Hoechst, 450/40 nm bant ile toplanan mavi bir sinyal iletir ve 610/20 nm filtrede kırmızı floresan olarak uyarılmasıyla filtreden geçer. SP, hem Hoechst mavi hem de kırmızı için negatif olan hücresel popülasyon sayısı olarak karakterize edilebilir [59]. Ewing sarkomunun STA-ET-1 hücre hattının incelenmesiyle gösterildiği gibi, Hoechst renginin gruplandırılması ile farklılaşmamış hücrelerin bağlantılarını kesme yeteneği arasında ayırt edici bir ilişki vardır [48].
Rh123, aktif hücreleri diğer hücrelere göre daha yüksek çözünürlükte boyayan SP ölçümünde kullanılan bir mitokondriyal boyadır. Rh123’ün floresan gücü, mitokondri kütlesi ile ilgili çoklu ilaç akım pompası aktivitesinin yanı sıra aktivasyon durumunu da gösterir. Rh123’ün genişleyen akışı, hücreler içinde daha az boya birikimine yol açar [93]. 488 nm’de daha az sitotoksisite ve uyarım Rh123’ün pratik kullanımı için etkilidir. Hoechst 33342 ve Rh123’ü kullanan çift renkli bir akış prosedürü, hematopoietik farklılaşmamış hücrelerden yüksek aktiviteye sahip olan hücreleri ayırmak için uygun olabilir. R482 pozisyonunda nokta mutasyonu taşıyan hücreler, bu hücreler tarafından kullanımlarını sınırlayan yüksek Rh123 akışına sahip kemoterapötiklere karşı daha dirençlidir [103].
SP incelemesi, örneğin 395-410 nm dalga boyunda mor bir lazerle uyarılan porlu hücre ve DNA bağlayıcı bir boya olan mor boya döngüsü (DCV) gibi diğer floresan renkleriyle de yapılabilir. Çoğu akım sitometri cihazında erişilebilen mor lazerin aksine, UV lazerlerine erişilemez. Buna göre, bu boya SP tahlilinde kullanılan Hoechst gibi diğer organik boyaları değiştirir [80-84]. İndolin boya ZMB793, 488 nm’de enerji verilen ve 600 nm ve daha uzun dalga boylarında yayılan floresan yapılı bir başka boyadır. Sınırlayıcı olan faktör ise bu boyanın akış sitometresi [100-104] dışında olan bazı yüksek cihazlarda kullanılamamasıdır.
Yoğunluk farkını ayırıcı faktör olarak kullanan gradyan santrifüjü, farklı hücre türleri için bir ayırt etme stratejisi ve CSC’lere bağlı fiziksel özelliklerin sınırlandırılmasıdır. Bu yöntemde canlı hücrelerin ayrılmasını sağlayan, farklı yoğunluktaki gradyan ortamıdır [112]. Bir hepatoselüler karsinom (HCC) modelinde, hücrelerin kalınlığına göre perkol tutarlı gradyan santrifüjleme kullanılarak çeşitli özelliklere ve biyobelirteç artikülasyon seviyelerine sahip dört kısım elde edilmiştir. Elde edilen kısımlar arasında, daha yüksek çekirdek/sitoplazma oranına ve ayrıca yüksek SC markör ekspresyon seviyelerine sahip olan kısımlarda malign kök hücrelerin varlığı doğrulanmıştır. Kök hücrelerin ayrılması için bu strateji kullanıldığında daha karşılaştırılabilir sonuçlar elde edilebilir. Örneğin, progenitör kemik iliği hücrelerinin, bu strateji kullanıldığında daha çok perkol gradyan ile sınırlı olduğu görülür. [75-79].
Yukarıda gösterildiği gibi, CSC modelini destekleyen kanıtlar geliştirilmektedir. Birçok durumda, CSC’lerle ilgili tartışmalar hala sürmektedir. CSC’lerin nasıl oluştuğu henüz belirsizdir. Farklı dokulardaki tipik farklılaşmamış hücrelerin, örneğin kalıtsal ve epigenetik dönüşümler gibi çeşitli faktörler tarafından malign hücrelere dönüştüğü varsayılmıştır [49, 53]. Kalıtsal olarak tümörleşmenin sadece CSC’lerde görülüp görülmediği henüz anlaşılmamıştır. Güçlü tümörler genelde geniş genomik kararsızlık gösterse de, CSC’lerde genomik sağlamlık ile ilgili veri yoktur. Devam eden bir araştırmada CSC’ler ve CSC olmayan hücreler arasında dönüşüm incelenmektedir [73]. Bu araştırma, malign hücrelerin farklılaşmasının CSC’lerin oluşumunu beraberinde getirme olasılığını göstermiştir. Bu çok yönlülük, CSC modelinde gözlemlenen düzensizliklerle ilişkili olabilir. Genel olarak görülen bir başka düzensizlik, CSC’lerin her zaman yaygın olmamasıdır; bu görüş, akut miyeloid lösemi (AML) kök hücreleri hakkındaki ilk bilgilere dayanmaktadır [106]. Bununla birlikte farelerin mikroçevresi, insan malign hücrelerinin büyümesi için uygun değildir ve tümörün nüksetmesiyle yaşam süresini 2 yıl ile sınırlar. Birkaç incelemede, zeno-transplantasyonun altında yatan sorun araştırılmaktadır. HCC fare modelinde, CD133 + CD45—alt popülasyonu, çıplak fare suşunda kansere neden olmuştur [67]. Malign kök hücrelerin daha fazla incelenmesi ve aydınlatılması için farklı hayvan modelleri geliştirilmelidir.
Bu kök hücrelerin kanser biyolojisinde tümör oluşumuna neden olduğu belirgindir. Yerleşik hücre hatlarından kimyasal tarama yöntemleriyle seçilen CSC’ler, in vitro deneylerin gerçekleştirilmesi ve analiz edilmesi için kullanışlıdır. CSC’lerin hastalar üzerindeki etki mekanizmaları henüz keşfedilmemiş olduğundan, hücreleri klinik örnekler aracılığıyla araştırmak için gelecekteki çalışmalara ihtiyaç vardır. CSC’lerin kanser gelişimindeki etkileri henüz belirlenemese de, geleneksel kemoterapiler CSC’leri ortadan kaldıramamaktadır. CSC’lerin hedeflenmesi, metastaz ve nüksün tedavisi için yeni ilaçlar geliştirilmesine öncü olabilir.
KAYNAKÇA:Cancer Stem Cells: New Horizons in Cancer Therapies, Editörler: Surajit Pathak Antara Banerjee
ÇEVİRİ: Şevval Kılıç/Fulya Baki
