6. BÖLÜM: Başlangıç Malzemesinin Üreticiye Onaylı ve Ticari Olarak Temin Edilebilir Otolog CAR-T Hücre Tedavisinin Sağlanması

Halvard Bonig, Christian Chabannon , and Miquel Lozano

 

Giriş

CAR-T hücre üretimi, aferez kullanan hastadan mononükleer hücrelerin(MNC'ler, özellikle preparat için sadece T lenfositleri kullanılacaktır) toplanmasından başlar. Her ne kadar allojenik CAR-T hücrelerinin gelişimi üzerinde çeşitli girişimler çalışıyor olsa da, şu anda sadece otolog kökenli CAR-T tedavileri Avrupa Birliği'nde onaylanmıştır. Bu bölüm sadece halihazırda veya yakında pazarlanacak otolog CAR-T hücrelerini tartışmakta ve araştırma amaçlı CAR-T hücrelerini veya ARI-001 ürünü gibi hastane muafiyeti bağlamında onaylanan nadir CAR-T hücreleri hariç tutmaktadır. (Ortiz-Maldonado et al. 2021); bu konuda lütfen Bölüm 3'e bakın.

CAR-T merkezleri olmak isteyen kurumlar, aferez yuvalarına anında erişim sağlamak için yeterli aferez kapasitesine sahip olmalı; aferez kapasitesi, CAR-T programı ile senkronize olarak büyümelidir(Tables 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, and 6.5).

Tablo 6.1 Aferez toplama öncesi

• Aferez üniteleri, hastaların CAR-T tedavileri için taranması sırasında muayene gerektirebilir.
• Muayenede aşağıdaki hususlar değerlendirilmelidir (Yakoub-Agha et al. 2020)
• Dolaşımdaki T lenfositlerin sayısını ve işlevselliğini etkileyen ilaçları (örn. steroidler, immün sistem baskılayıcıları ve kemoterapi) aferezden mümkün olduğunca uzun süre önce bırakın. Minimum durdurma kuralları, kurumsal kılavuzlarda ve üretim izin sahibi (MAH) talimatlarında tanımlanmıştır. Steroidler genellikle aferezden en az 3-7 gün önce durdurulur.
• Özellikle intravenöz santral hattı olan hastalarda sistemik enfeksiyon açısından değerlendirin. Bakteriyemi, ürünün kontaminasyon(enfekte olma)riskinden dolayı MNC aferezinden uzak göreceli bir kontrendikasyondur(tedavi için ideal olmama durumu).Bununla birlikte, kontamine bir kan ürününün kesinlikle ideal olmamasına rağmen- üretici tarafından her zaman reddedilmediğini unutmayın,çünkü üretim süreci antibiyotik artışını planlayabilir
• Santral bir kateterin yerleştirilmesi gerektiğine karar vermeden önce, ideal olarak üst koldaki periferal venler palpasyonla kontrol edilir yeterli değilse bir ultrason değerlendirmesi de dahil olmak üzere venöz erişimi değerlendirin (Gopalasingam ve ark. 2017) Peripberal erişim lokasyonları aracılığıyla çoğu yetişkin hastadan kan alınabilir.Merkezi kateterlere en çok düşük kilolu çocuklarda ihtiyaç duyulur. kalıcı kateterler uygundur(Jariscb et al. 2020).

 

• Çocuk doktorları ve aferez tıbbi direktörü veya pratisyeni arasında ortak bir değerlendirme yoluyla herhangi bir sedasyonun(sakinleştirmenin) gerekli olup olmadığını (çoğunlukla pediatrik popülasyon için) değerlendirin.
• Hedef işlem hacmini hesaplamak için tam kan sayımı (CBC) ve diferansiyel (mutlak Lenfosit sayısı) sonuçlarını inceleyin.
• Beta talasemi minör varlığını ekarte etmek için MCV'yi kontrol edin. Mikrositoz, aferez ayarlarının değiştirilmesini gerektiren anormal sedimantasyon davranışına yol açar(Constantinou et al. 2017)
• Boy ve kiloyu not edin ve toplam kan hacmini hesaplayın. özellikle, düşük kilolu çocuklarda, aferez tüp setinin ışınlanmış kırmızı kan hücresi konsantresi (aferezin başlatılmasını geciktirmemek için önceden sipariş edilmesi gerekir) ile doldurulması gerekliliğini göz önünde bulundurun.
• Hastaya aferez toplanmasından önceki günlerde hücresel bileşenler nakledilirse, bunlar gama ışınına maruz bırakılmalıdır.
• Eşzamanlı ilaçları, özellikle de anti-hipertansifleri not edin. Anjiyotensin dönüştürücü enzim inhibitörleri ve beta blokerler, aferez sırasında hipotansiyon reaksiyonları riskini artırır.
• Elektrolit seviyelerini değerlendirin: potasyum, (iyonize) kalsiyum ve magnezyum seviyeleri aferez sırasında düşer ve bu nedenle aferezden önce zaten anormal ise kritik derecede düşük olabilir (Stenzinger ve Bonig 2018).
• HIV, HBV ve HCV'nin negatif enfeksiyöz belirteçleri (bazı ülkelerde ayrıca HTLV-1 ve sifiliz), otolog hücre ürünlerinde geçerli yasa ve yönetmeliklere uygun olarak, toplamadan sonraki 30 gün içinde mevcut olmalıdır. MAH, başlangıç malzemesinin üretim sahasına gönderilmesinden sonra sonuçların hazır olmasını isteyecektir.

Tablo 6.2 Aferez koleksiyonunun tasarlanması

• Koleksiyona uygun aferez platformunu seçin. Seçilen platforma bağlı olarak toplanan ürünün özellikleri önemli ölçüde değişebilir. Örneğin Amicus ayırıcı (Fresenius-Kabi, Bad Homburg, Almanya) kullanılıyorsa trombosit içeriği Spectra Optia'ya (Terumo BCT, Lakewood, CO, ABD) göre çok düşüktür (Cid et al. 2019),
• -Hastanın toplam kan hacminin aferez separatörünün doldurulmasını gerektirip gerektirmediğini kontrol edin.
• -İşlenecek kan hacmini tanımlamak için lenfosit sayısını kontrol edin, farklı üreticilerin aferez hedefleri için Tablo 6.4'e bakın.
• -İşlenecek hacme bağlı olarak, toplama sırasında profilaktik kalsiyum ve magnezyum uygulamasını değerlendirin  (Sörensen et al. 2013).
• -Hemoglobin ve trombosit sayısını değerlendirin, koşullara bağlı olarak aferezden önce veya sonra transfüzyonu değerlendirin. 7 g/dL, daha iyisi 8 g/dL'lik bir hemoglobin seviyesi, aferez öncesi aferez sırasında interfaz oluşumunu kolaylaştırır. Spectra Optia, trombosit sayısını işlenen toplam kan hacmi başına yaklaşık %11 oranında azaltacaktır.
• -Potasyum seviyesini değerlendirin ve takviye düşünün.
• Tablo 6.3 Toplama için tipik olarak kullanılan aferez programlarının özellikleri

	Amicus	Spectra Optia
Üretici	Fresenius-Kabi (Bad Homburg, Germany)	TerumoBCT, Lakewood, Co USA
Yazılım kiti		Sürekli	MNC
Akış tipi	Süreksiz	Sürekli MNC	Çift aşamalı ayırma
Akış hızı	10-80mlmin	10-142mlmin	10-125mlmin
Operasyon	Otomatik	Yarı otomatik	Yarı otomatik
Mononükleer hücre tabakası	Yıkama	Aspirasyon	Aspirasyon ardından yıkama
Trombositler	Bağışçıya geri döndü	Toplanmış	Bağışçıya kısmen geri döndü

’Lökosit sayısına bağlı’’

• Tablo 6.4 Farklı CAR-T terapi üreticilerinin toplama gereksinimleri

Ürün	Axicabtagene ciloleucel	Brexucabtagene autoleucel	Tisagenlecleucel	Lisocabtagene maraleucel	İdecabtagene vicleucel	Ciltacabtagene autoleucel
Kaydedilmiş isim	Yescarta	Tecartus	Kymrirah	Breyanzi	Abecma
Üretici	Gilead	Gilead	Novartis	Juno-Celgene-BMS	BluBİrd-Bio-Celgene-BMS	Legend Therapeutics- Janssen
Tanımlanmış antijen	CD19	CD19	CD19	CD19	BCMA	BCMA
Aferez sırasında hedef hücre dozu	5-10×10⁹ MNCs		1-4 ×10⁹CD3 ≥2 ×10⁹TNCs ≥3% CD3+ TNCs
İşlenecek hedef hacim	12-15L		6-10L

 

Tablo 6.5 Ara depolama, kriyoprezervasyon ve lojistik

*4-8 °C'de ara depolama

*Konsantrasyonu 108/mL (0,5-2 x 108) ayarlayın; mümkün olan en kısa sürede dondurun ancak kontrollü bir oranda kriyoprotektan olarak DMSO ile toplandıktan sonra en geç 24 saat içinde dondurucuda; LN2'de saklayın (kurumsal SoP, üretim operasyonuna başlamadan önce üretici tarafından doğrulanacaktır.

 *Diğer tüm CAR-T hücreleri: Üreticilerin talimatlarına ve gereksinimlerine göre mümkün olan en kısa sürede 4-8 °C'de gönderin.

 *MAH, uygun sıcaklığa sahip sıcaklık kontrollü nakliye konteynırları ile teslim almayı ayarlayacaktır.

*Planlama,programlama, toplama, teslim etme ve izleme belgeleri MAH tarafından sağlanan özel web araçları tarafından desteklenir.

 

Önemli noktalar:

*Hastanın klinik ve biyolojik durumunu değerlendirerek aferez için hazırlanın.

 *İmmün efektör hücre sayılarını ve fonksiyonlarını azaltabilecek tedavileri bırakın.

*Aferez parametrelerini hasta durumuna göre ayarlayın.

 *Üreticinin ihtiyaç ve gereksinimlerine uyacak şekilde aferez parametrelerini uyarlayın.

 *Üreticinin ihtiyaç ve gereksinimlerine uygun olarak üretim sahasına sorunsuz sevkiyatı sağlamak için Hücre İşleme Tesisi ile sıkı bir şekilde koordine olun.

 

 

7. BÖLÜM : Üretim Tesisinden Gönderilen CAR-T Hücrelerinin Alınması, Taşınması, Depolanması, Çözdürülmesi, Dağıtılması ve Uygulanması

Catherine Rioufol ve Christian Wichmann

Tanım

      Antijen reseptörü T hücresi (CAR-T hücresi) tedavileri için üretim sürecinde hastanın T hücreleri; zenginleştirme, genetik modifikasyon, ve genişletme işlemlerinden sonra tıbbi ürün statüsü kazanır.

      CAR-T için kodlama yapan, tümör antijenini tanıyan, tümör hücrelerini parçalayan ve bağışıklık sistemini aktive eden bir trans genin yerleştirilmesinden kaynaklı bu farmakolojik etki için bkz: Bölüm I’de 1,2 ve 3. Ayrıca  CAR-T hücreleri kan sistemi içindeki antijen-pozitif hücrelerle etkileşim ile büyük ölçüde genişler böylece uygulanan ATMP hücre sayısını yüksek sayılara çıkartır (June ve arkadaşları, 2018). Bu farmakolojik mekanizma nedeniyle CAR-T hücreleri, hücresel yapılarına rağmen gen terapisi tıbbi ürünleridir. Hem hasta  hem sağlıklı donörlerden elde edilen CAR-T hücreleri, Avrupa Parlamentosu’nun EC N˚ 1394/2007 sayılı Yönetmeliğinde ve 2001/83/EC sayılı Yönetmeliği ve N˚ 726/2004 sayılı Yönetmeliği değiştiren ATMP’ler hakkındaki 13 Kasım 2007 tarihli Konseyin 2009/120/EC sayılı Direktifinde tanımlandığı gibi ATMP’ler ileri tıbbi tedavi ürünleri sınıfına aittir. Bu tıbbi statünün bir sonucu olarak, CAR-T hücreleri hastane eczacısının sorumluluğu altındadır. Üretici, piyasaya sürülen ilaçları tedavi merkezinin eczanesine gönderir; her adımından hastane eczacısı sorumludur: CAR-T hücrelerinin piyasada olup olmadığına veya klinik bir çalışmada deneysel olarak kullanılıp kullanılmadığına bakılmaksızın alım, taşıma, depolama, çözme ve dağıtım (Pinturaud ve arkadaşları, 2018).

      Hücre İşleme Tesisi olan hastanelerde eczane, dahili bir anlaşmada tanımlandığı şekilde, belirli teknik işlemleri Hücre İşleme Tesisine taşeron olarak vermeyi seçebilir. Genel kullanım ve çalışma süreci, yerel ve ulusal sağlık yetkilileri tarafından uygulanan yasal gerekliliklere ve ilacı üreten şirketin teknik gerekliliklerine (denetimler ve eğitim kursları yoluyla kontrol edilir) uygun olmalıdır.

İş Akışı	Sürecin tanımlanması
Taşıma	- CAR-T hücrelerinin ATMP gereksinimlerine göre taşınması, ürün güvenliğini ve sağlık çalışanlarının korunmasını sağlar. “CAR-T yolunun” çeşitli aşamalarında yer alan taşıma ekibini korumak için kişisel koruyucu ekipmanlar (PPE) kullanılır. - “CAR-T hastane yolu” eczacı tarafından denetlenir; adımlar, hedefleri karşılamak ve hastanın bakım yolunu kolaylaştırmak için Hematoloji Departmanının tıbbi ve hemşirelik ekipleriyle koordinasyon halinde farmasötik ekip tarafından belirlenir. - Farmasötik laboratuvarların merkez yeterliliğine ek olarak, katılan herkes için temel ve süregelen eğitim programları ve periyodik değerlendirme içeren güvenilir ve uyum sağlanmış bir kalite güvence sistemine ihtiyaç vardır. - Birçok merkezde CAR-T hücre ürünleri, kanserli hastaların takibi ve tedavisiyle ilgilenen ve onkoloji departmanıyla yakın temas halinde olan uzman onkoloji farmasötik ekipleri tarafından idare edilmektedir. - Üretici tarafından personel eğitimi ve yerinde denetim yapılır. - Üretici tarafından sağlanan erişim ile web tabanlı iletişim araçları aracılığıyla süreç kontrolü yapılır.
Kabul ve Uygunluk Kontrolü	Kritik adımlar: - Endikasyonun pazarlama onayı/SmPC ile tutarlı olduğunu ve hastanın durumunun CAR-T hücrelerinin beklenen güvenlik profili ile uyumlu olduğunu inceleyen multidisipliner bir toplantı dahilinde tedavi onayı verilir. - Hastane eczacısının siparişi üretici firmaya verilir. - Hücre toplama tesisinde lökaferez yoluyla başlangıç materyalinin toplanmasının planlanması yapılır. (Tedaviyi yürüten hastane tarafından kullanılabilir veya başka bir hastaneye ya da kan bankasına taşeron olarak verilebilir.) - Hücre toplama tesisi ile yakın işbirliğiyle çalışan hücre işleme tesisinden başlangıç materyalinin sevkiyatı yapılır. (Hücre işleme tesisi tedaviyi yürüten hastane tarafından çalıştırılabilir veya başka bir hastaneye ya da kan bankasına taşeron olarak verilebilir.) - Üretim ve nakliyeye fırsat tanımak için sipariş ile teslim alma arasında 4-6 haftalık geri dönüş süresi vardır (Avrupa’daki ilk aktif merkezlerin deneyimlerine dayanarak). - Üreticinin web sitesinde isteğe bağlı tıbbi ürün üretiminin ardışık adımlarının izlenmesi, soğuk zincir kesintiye uğramadan alım için gerekli insan kaynaklarının harekete geçirilmesi için alım tarihi ve saatinin önceden bilinmesine izin verilmelidir. - CAR-T hücrelerinin genel sunumu: İnfüzyon için torba veya şırınga ile yaklaşık -160 ˚C‘ de kuru nakliyede (buhar fazlı nitrojen) teslim edilir. - Havalandırmalı tesislerde kuru nakliye alınır. - Alım belgeleri (dağıtım belgeleri, analiz ve serbest bırakma sertifikaları, sıcaklık kayıtları, etiketler) ile alımda uygunluk kontrolü yapılır:   * Dondurucu kutu yüzünde gözle görülür hasar ve/veya sızıntı olmamalıdır.   * Dondurulmuş hücre ürününün tam olarak incelenmesi için metal kaset açılmalıdır.   * CAR-T hücre etiketinde yazan bilginin doğruluğu ve eksiksiz olduğu kontrol edilmeli: Hasta kimliği ve ilaç kimliği   * Doğru etiketleme, tıbbi ürünün amaçlanan alıcıya ulaştırılmasına kadar üretim süreci boyunca Kimlik Zincirini/Gözetim Zincirini korumak için önemlidir. - Yedek çanta: Üreticinin sitesinde bir yedek çanta bulunup bulunmadığı alım belgelerinde sistematik olarak belirtilmelidir. Alım sırasında tespit edilen herhangi bir uygunsuzluk durumunda bu bilgi eczacı ve hematologların tedavi stratejilerini belirlemede çok önemlidir. Yedek bir çanta, kusurlu CAR-T hücrelerinin değiştirilmesi yoluyla 48 saat içinde ilaç uygulamasının zamanında yapılmasına olanak sağlar. - Alınan tüm bilgiler üreticinin web sitesine kayıt edilir. - CAR-T hücreleri kriyojenik (dondurulmuş) bir alıcıya aktarılmalıdır. - Sıcaklığın standart aralığın dışında olması veya oluşabilecek başka anormalliklerin yönetilmesi: CAR-T hücreleri karantinada saklanmalı ve talimatlar için üreticiyle iletişime geçilmelidir. - Teknik Özelliklerin Dışında (OOS) son kontrol yapılmalıdır. - Alım uygunluk kontrolü ve kriyojenik alıcıya transferi için eczane ekibinin iki üyesini veya eczane ve hücre işleme tesisinden birer üyeyi içeren ikili kontrol yapılmalıdır.
Depolama	- Buhar fazlı nitrojen tanklarında depolama yapılır. Hücre işleme tesisi bulunan hastanelerde özel bir nitrojen tankında depolama mümkündür. İlgili sorumluluklar daha sonra sağlık müdürlüğü tarafından onaylanan bir anlaşmada tanımlanır. - Kriyojenik tesisler genellikle herhangi bir arızalanma durumunda yedekleyebilmek için birkaç nitrojen tankı içerir. Birkaç farklı tankın olması piyasa iznine sahip CAR-T hücrelerinin klinik çalışmalarda kullanılanlardan veya diğer ATMP’lerden ayırt edilmesini sağlar. Tanklar merkezi bir dolum tankı tarafından doldurulur. Dolum otomatik olmalı, seviyeler anlık olarak izlenmeli ve alt eşikte 7/24 çalışan bir alarm bulunmalıdır. Sıcaklık seyri düzenli olarak izlenmeli, kaydedilmeli ve kontrol edilmelidir. - Nitrojen depolama süresi yaklaşık 6 aydır. - CAR-T hücrelerinin kriyojenik alıcılardaki nitrojenin içine ve dışına taşınmasında yanık ve hipoksi kazalarının önlenmesi: Eğitimli ve deneyimli personele ayrılmış güvenli erişime sahip havalandırmalı tesisler olmalı, kriyojenik alana tek başına erişim olmamalı ve herhangi bir olayın dışarıdan tespit edilebilmesi için kapıda bir oculus(**) bulunmalıdır. Kattaki oksijen seviyeleri anlık olarak kaydedilir ve hastane güvenlik merkezinde görsel ve sesli alarmlarla görüntülenir. Nitrojen depolama sembolü görüntülenir. İlk yardım prosedürleri tesis içinde ve dışında piktogramlarla belirtilmiştir. - Çalışanların korunması: Azot temasından kaynaklanan yanmaları önlemek için PPE (kolları dirseğe kadar olan eldivenler, koruyucu gözlükler, laboratuvar önlüğü ve ayakkabılar) kullanılmalıdır. Sıvı nitrojen kullanımı için kurumsal standart kullanım prosedürlerini takip edin. - Organizasyon: Eczane açılış saatleri dışında herhangi bir arıza durumunda müdahale edebilmek için geceleri, hafta sonları ve tatil günlerinde sırayla nöbet tutulmaktadır. - Düzenli bakım, tesislerin ve tankların iyi çalışmasını sağlar.
Çözülme	- Depolama tankından tıbbi ürün çıkarıldıktan sonra uygulamada herhangi bir hatayı önlemek için tekrar bir çift kontrol (dört göz prensibi) gereklidir. Bu; hasta kimliğini, doğum tarihini, aferez-ID ve parti numarasının doğru bir şekilde kontrol edilmesini içerir. - Ürün ile hematolog reçetesi arasındaki uygunluğun kontrolü: Hasta kimliği, CAR-T adı, uygulama tarihi. - Son kullanma tarihi kontrol edilmelidir (CAR-T hücreleri -160˚C’nin altındaki sıcaklıklarda birkaç ay boyunca stabil kalabilse de). - Hematolog yeşil ışık yaktıktan sonra çözülme işlemi başlar. - Çözülme işlemi:   İlaç ekibi tarafından uygulama gününde, işlem mümkün olduğunca kısa sürede gerçekleştirilir; bu Hematoloji Bölümü ile koordineli bir planlama gerektirir.   Eczane tesislerinde, (ya da taşeron olarak çalışılıyorsa hücre işleme tesisinde) CAR-T hücrelerinin torbası temiz bir odada koruyucu bir plastik torbaya çift sarıldıktan sonra torbadaki tüm buz kristalleri eriyene kadar 37-+2˚C’lik özel bir su banyosunda bekletilir. Yerel organizasyona bağlı olarak kuru çözdürme yöntemi de kullanılabilir.   Öneri: CAR-T hücrelerinin torbasını korumak ve orijinal torbanın kazara delinmesi nedeniyle alım sırasında gözden kaçmış olabilecek herhangi bir çözelti sızıntısını gözlemlemek ve kontrol etmek için torbayı çözdürmek için su geçirmez bir plastik torbaya iki kez sarın.   Çözüldükten sonra CAR-T hücreleri, üreticisine bağlı olarak oda sıcaklığında yaklaşık 30 ile 90 dk. boyunca stabildir. (Lütfen SmPC’ ye ve üreticinin talimatlarına bakın.) - Genellikle hiçbir hazırlık aşaması (yıkama, sıkma vb.) gerekmez veya buna izin verilmez. - Ticari ürünlerden numune alınmamalıdır.
Hazırlık	- Dağıtımdan önce işlem gerektiren CAR-T hücreleri olması halinde, ürünün mikrobiyolojik bulaşma riskini önlemek ve personel ve çevreye yönelik riskleri en aza indirmek için hava geri dönüşümü olmayan dikey laminer hava akışına sahip basınçlı bir hazırlık odasında enjeksiyon hazırlığı yapılmalıdır.
Hematoloji Bölümüne taşıma	- Çözdürme ve uygulama arasındaki süre üreticiye bağlı olarak 30 ile 90 dakikadır ve hücrelerin oda sıcaklığında özel ve belirgin bir kap için eczaneden uygulama bölümüne taşınması da dahil olmak üzere hassas bir zamanlama gerektirir.   Uyarı: CAR-T hücre ortamında, oda sıcaklığında hücre kalitesini ve canlılığını bozan bir kriyopreversasyon ajanı olan dimetil sülfoksitin (DMSO) varlığı söz konusu olduğundan, üreticinin tavsiye ettiği aralığa uymak bilhassa önemlidir (Li ve arkadaşları, 2019). - Çoğu durumda, CAR-T hücrelerinin çözüldükten sonra kısa ömürlü olması ve uygulanmaması durumunda hastanın ölüm riski nedeniyle, eczacı veya eczane personelinin bir üyesi tarafından taşınması önerilir.
Hematoloji Bölümünde dağıtım	- Eczaneden, tercihen Hematoloji Bölümünde enjeksiyondan sorumlu hemşireye verilmek üzere uygulamaya hazır bir form altında dağıtım yapılmalıdır. Dağıtım zamanı kaydedilmelidir. - Eczacı tarafından hemşirenin özellikle lökosit tüketmeyen (non-leukodepleting) in-line filtre dahil olmak üzere tüm spesifik uygulama cihazlarına sahip olup olmadığı kontrol edilmelidir. - CAR-T hücre ürünü ile temas etmiş olan tüm materyaller (katı ve sıvı atıklar) potansiyel olarak bulaşıcı atıklar ve genetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO’lar) olarak yerel biyogüvenlik kılavuzlarına, yerel ve ulusal yönetmeliklere uygun olarak taşınmalı ve imha edilmelidir.
** Oculus: Bir kubbenin merkezinde veya bir duvarda bulunan daire şeklinde açıklık.

 

   İlacın Uygulanması

      CAR-T hücre enjeksiyonundan beş ile yedi gün önce lenfodepleting kemoterapisine başlanır (Maus ve June 2016). Uygunsuzluğun uygulamayı engellediği durumlarda hasta lenfosit seviyelerini gereksiz yere düşürmekten kaçınmak için CAR-T ATMP’nin alınmasının ve uygunluk kontrolünün beklenmesi önerilir.

      CAR-T hücre uygulaması, Hematoloji Departmanı tarafından eczane ekibi ve Hücre İşleme Tesisi ile koordineli olarak uygulama gecikmesi olmadan optimum koşullar altında devrenin tamamlanmasına izin verilecek şekilde planlanır. CAR-T hücre infüzyonu da dahil olmak üzere tüm CAR-T işlemleri için hasta bilgileri ve onayı hematologlar tarafından önceden alınır.

      Hücreler, periferik veya merkezi bir kateter aracılığıyla ön ısıtma olmaksızın 10-20 mL/dak infüzyon hızında (yerçekimi akışı) intravenöz olarak verilir. Lökosit tüketmeyen (non-leukodepleting) in-line filtre kullanılır.

      Bazı merkezlerde eczacı, hemşirenin extradan bir cihaz isteme gibi herhangi bir ihtiyacına cevap verebilmek için yatak başında hazır bulunur. Fiziksel olarak orada bulunmasa bile eczacı, talep üzerine hızlıca hazırlanabileceği bir yerde bulunmalıdır.

      Hastanede kalış süresi yaklaşık olarak 2 haftadır ancak yoğun bakım ünitesine nakil gerektirebilecek sitokin salınım sendromu (CRS) veya nörotoksisite gibi majör olumsuz olaylar söz konusu olduğunda bu süre daha da uzayabilir. Hastane eczanesine düşen bir diğer önemli sorumluluk da SmPC’ ye uygun olarak tedavi edilen her hasta için iki doz tosilizumabın (anti-IL-6R antikoru) hemen hazır halde bulundurulmasını sağlamaktır.

   CAR-T Hücreleri ile Tedavi Edilen Hastalar: Hastane Eczacıları için Yeni Görevler

      CAR-T yolundaki adımlar, hastane eczacısının bu terapötik yenilikteki rolünü vurgulamaktadır.

      Gelecekte artan ATMP sayısı ve çeşitliliği, eczane organizasyonunda, özellikle de çeşitli ATMP türlerinin uygun ve güvenli bir şekilde ele alınması için tesis ve ekipman (örn. nitrojen tankları ve dikey laminer hava akışlı davlumbazlar) açısından önemli değişiklikler gerektirebilir: somatik hücre tedavisi tıbbi ürünleri, gen tedavisi tıbbi ürünleri (CAR-T hücreleri dahil) ve aselüler gen tedavisi tıbbi ürünleri, doku mühendisliği ürünleri ve kombine tıbbi ürünler gibi diğer ATMP kategorileri.

   Önemli Noktalar:

* Yüksek tıbbi standartlara sahip hücre tedavisi ürünlerinin hastane eczacıları tarafından denetlenmesi

* Dondurarak muhafaza: Ürün güvenliğini sağlayan ve ilgili personelin fiziksel güvenliğini korumak için sıkı önlemlerin uygulanmasını gerektiren katı biçimde düzenlenmiş bir çalışma ortamı

* Hücre depolama alanının 7/24 izlenmesi de dahil olmak üzere yüksek teknik gereksinimler

* Hasta yolu: CAR-T hücrelerinin alınmasından sonra lenfodepletion kemoterapisinin planlanması

* Kabul belgesinde yedek bir çantanın mevcut olup olmadığına ilişkin ifade

* Genel olarak; süreç, farklı tesislerde yürütülür ve iyi iletişim becerileri ve multidisipliner bir yaklaşım gerektirir.

 

 

8. BÖLÜM:  CAR-T Hücrelerini Bakım Noktasında Üretimi

Julio Delgado, Claire Roddie ve Michael Schmitt

      Klinik uygulama için CAR-T hücreleri ileri tedavi tıbbi ürünleri (ATMP’ler) olarak sınıflandırılır ve bunların üretimi Avrupa İlaç Ajansı (EMA) ve federal ve bölgesel yetkililer tarafından yönetilen yasa ve yönetmeliklere bağlıdır. CAR-T hücreleri; yakın kontrollü, tekrarlanabilir ve denetlenebilir koşullar altında standartlaştırılmış yöntemlere göre güvenli bir şekilde üretilen güçlü ürünler olarak tanımlanan iyi üretim uygulamaları (GMP) ile uyumlu olacak şekilde üretilmelidir. BioPharma, hastalar için CAR-T ürünlerinin büyük çoğunluğunu tedarik etmektedir. Ancak bazı akademik merkezler, CAR-T hücrelerine hasta erişimini iyileştirirken ve tedavi maliyetlerini düzene sokarken CAR-T üretim kapasitesini aynı ürün kalitesinde tutmaya çalışarak cGMP bakım noktası ürünlerini geliştirmiştir. CAR-T bakım noktası üretimi yalnızca uygun mevzuata ilişkin onaylara sahip tesislerde gerçekleştirilebilir.

   GMP Vektör Üretimi

      Retroviral ve lentiviral vektörler CAR-T üretiminde kullanılan en yaygın gen iletim yöntemleridir. Viral vektörler düzenleyici kurumlar tarafından bir ara reaktif olarak kabul edilse de üretimde cGMP koşullarına uyulması tavsiye edilmektedir.

      Vektör üretimi Rockfeller Üniversitesi ile uygun lisans anlaşmalarının yapılmış olduğu varsayılarak genellikle bir ana hücre bankasından (MCB) türetilen HEK293T paketleme hücre hatları kullanılarak B sınıfı temiz odalarda A sınıfı laminer akış kabinlerinde gerçekleştirilir. MCB’nin kalite kontrolü Tablo 8.1’ de ana hatlarıyla açıklanmıştır (Perpina ve arkadaşları, 2020).

      Gen transdüksiyonu veya gen düzenlemesi için viral olmayan teknikler, preklinik ve erken klinik çalışmalarda araştırılmaktadır (Prommersberger ve arkadaşları, 2021).

      Vektör üretim süreci 10 ile 14 gün sürer ve burada ana hatlarıyla açıklanmıştır. Flakslarda paketleme hücreleri genişletilir ve hücre kültürü odalarına aktarılır, ardından polietilenimin kullanılarak plazmit transfeksiyonu yapılır. CAR, viral zarf ve glikozaminoglikan proteini kodlayan sabit miktarlarda plazmit gereklidir.

      Transfeksiyonun ardından salgılanan vektör içeren süpernatantlar toplanır, 0.45 mm membranlar kullanılarak berraklaştırılır, diafiltrasyondan önce konsantre edilir, aliquotlar halinde dondurulur ve kullanılana kadar -80 ˚C’ de saklanır. Kalite ölçütleri Tablo 8.2’ de ana hatlarıyla belirtilmiştir (Castella ve arkadaşları, 2019).

Tablo 8.1 HEK293T ana hücre bankası için kalite kontrolü
Değişkenler	Yöntem	Kabul ölçütü
Görünüm	Gözle inceleme	İnce uzantılara sahip yapışık hücrelerin varlığı
Sterilite	Mikrobiyal büyüme	Steril
Mikoplazma	PCR	Yok
Adventif virüsler	PCR	Yok
Karyotip	G-bandı boyaması	Bilgilendirici
Çözülme sonrası hücre canlılığı (%)	Tripan mavisi dışlama ile neubauer hücre sayımı	>70%

 

Tablo 8.2 GMP sınıfı virüs üretimi için kalite kontrolü
Değişkenler	Yöntem	Kabul ölçütü
Görünüm	Gözle inceleme	Sarımtırak sıvı çözelti
Viral titre	Sınırlayıcı seyreltme	>3.75*10⁷ TU/mL
Sterilite	Mikrobiyal büyüme	Steril
Mikoplazma	PCR	Yok
Özdeşlik	PCR	Pozitif
Replikasyon yeteneğine sahip lentivirüs	Eş zamanlı PCR	Yok

 

CAR-T Hücresi Üretimi

CAR-T hücresi üretimi, ürünün kirlenme riskini azaltmak için kapalı veya işlevsel olarak kapalı bir sistemde, onaylı CGMP temiz oda tesisinde yaklaşık 8 günden fazla gerçekleştirilmiştir (Roddie ve d. 2019; Schubert ve d. 2019; Castella ve d. 2020).

 

 CAR-T hücreleri için başlangıç malzemesi, mobil olmayan lökoferezden türetilen CD3+T hücrelerini içerir (bkz. Bölüm 6). Akademik üreticilerin toplam çekirdekli hücre (TNC'ler) ve CD3+T hücreleri için zorunlu leukapitza gereklilikleri, örnek olarak, Uni. Heidelberg 1-1D-CAR-1 protokolü (EudraCT No. 2016-004808-60) için 20 x 108 TNC ve 10 x 108 CD3+T hücre gerekir; bu, Novartis'in, tisagenlecleucel üretimine ilişkin gerekliliklerine benzer. Lökoferez malzemesi üretimden önce kriyoprezerve edilebilir, ancak üretim sürecini kısaltmak için yeni lökoferez materyali kullanmaya yönelik bir trend vardır. CAR-T Üretimi, Tablo 8.3'de belirtilen adım adım bir süreçtir:

Tablo 8.3 CAR-T üretim metodolojisi

	Potansiyel Metotlar	Timepoint
Adım 1: Lökoferez sonrası T hücresi zenginleştirme (opsiyonel)	Fikol yoğunluğu gradyanı santrifüjlemesi; süzerek arıtması; imunomagnetik boncuk seperasyonu	Gün 1
Adım 2: Sentetik antijen sunum teknolojileri kullanılarak T hücre aktivasyonu (CD3+/— CD28) (gerekli)	Çözülebilir monoklon antikorlar; Para-manyetik anti-CD3/CD28 antikor kaplı boncuklar; nanomatris içeren polimerik biyolojik olarak bozunabilir CD3/28 (TransAct•)	Gün 1ve 2
Adım 3: T hücresi uyarılması (gerekli)	Kültür medyumunda 11-2, IL-7 ve IL-15 (as per protocol) (Hoffmann et al. 2018; Gong et al. 2019)	Gün 1’den itibaren
Adım 4: Gen aktarımı/transdüksiyon retroviral veya lentiviral CAR vektörü ile (gerekli)	Bazı süreçlerde, transdüksiyon kalitesini artırmak için Retronectin veya Vectofusin ® kullanılır (opsiyonel)	Days 2, 3
Adım 5: T hücresi ekspansiyonu (required)	T-flask, tabak veya kültür poşetleri; biyoreaktörler, örn. G-REK.flask (Wilson Wolf Manufacturing); Xuri DALGASI. Bioreaktör (GE Life Systems); C1iniMACS Prodigy. (Miltenyi BioTec)	Gün 1’den itibaren
Adım 6: T hücresi toplaması ve kriyoprezervasyonu (gerekli)	Kriyoprezervasyon metodolojisi genellikle hamatopoietik hücreler için tanımlanan süreçleri yansıtır. Yöntemler arasında pasif donma bulunur. (-80°C dondurucu) ve kontrollü oranlı donma	Gün 8’den itibaren
Adım 7: CAR-T hücresi kalite güvenilirliği kontrolü ve salınımı testi	Ürünün sürüm kriteri spesifikasyonlarına uygun olduğundan emin olmak için süreç içinde ve süreç sonu kontrolleri alınır	Gün 8’den itibaren

 

Tablo 8.4 CAR-T hücresinin biyolojisi ve mikrobiyolojisi kalite kontrolü

Parametre	Metot	Kabul kriteri
Ökı9Görünüş	Görsel denetim	Bulutsu sıvı çözeltisi
CAR+ hücre (%)•	Akış sitometrisi	>%20
CD3+ hücre (%)	Akış sitometrisi	>%70
Hücre canlılığı (%)	Trypan mavisiyle Neubauer hücre sayma	>%70
Sterilite	Microbial growth E. Ph. 2.6.1	Bakteri/mantardan sterile
Mikoplazma	PCR'	Yok
Endotoksin	Kromogenik tahlil	<0.5 EU/mL

 

Opsiyonel/R&D

TE/TEM/TEMRA/TCM/IN altpopülasyonlarının belirlenmesi için CAR/CD45RA/CCR7	Akış sitometrisi	Hastada uzun süreli bir CAR-T hücresi etkisi için olgunlaşmamış T hücrelerinin yüksek bir oranı tercih edilir
Sitotoksik güç	Tümör CAR-T hücresi kokültüründeki CR-51 sürümü, akış sitometrisi ile değerlendirilmiştir	4 saatlik bir tahlilde 10:1 efektör/hedef oranında (veya daha yüksek oranda) >%40 öldürme
Harici hücreler	PCR	Yok
Transgene kopya/hücre sayısı	Real-time PCR (Kunz et al. 2019; Schubert et al. 2020)	<10 (aralık <7-15!) kopya/hücre

 

""Luna™ gibi otomatik hücre sayaçları önemle tavsiye edilir

Son derece spesifik algılama reaktifleri (örn., Miltenyi Detection Reagent™), CAR-T hücrelerini negatif fraksiyondan ayırt etmek için önemle tavsiye edilir

'Avrupa standartları, seroloji gerektiren ABD yönetmeliklerinin aksine PCR metodolojisini şart koşmaktadır

° Ülkeler ve ürünler arasında farklılık gösterir

Üretim tamamlandıktan sonra, CAR-T ürünleri analiz sertifikasında belirtilen kalite kontrolü/son ürün teknik özelliklerine uygun olmalıdır.

Parametreler değişiklik gösterebilir, ancak CAR-T ürünleri genellikle immünofenotipik, fonksiyonel ve sterilite değerlendirmelerine göre serbest bırakılmak üzere karakterize edilir (Tablo 8A). Spesifikasyon dışı (00S) bir ürün normal şekilde piyasaya sürülemez ve klinik kullanımı, 00S'lik bir rapor aracılığıyla bilgilendirilmiş düzenleyici otoritelerle uyum içinde tedavi eden doktorun takdirine bağlıdır.

Özet ve Önemli Noktalar

•           Point-of-Care/merkezi olmayan CAR-T hücresi üretimi, CAR-T ürünlerine hasta erişimini artırma potansiyeline sahiptir.

•           Sınırlamalar, lokal CGMP tesisleri/eğitimli personel gereksinimini ve birden fazla tesiste standardizasyon eksikliğini içerir.

•           Potansiyel çözümler arasında standartlaştırılmış, Miltenyi CliniMACS ProdigyTM gibi yarı otomatik olarak eşleştirilmiş üretim platformlarının uygulanması ve hastalar arasında sürekli, yüksek kaliteli ürünlerin üretilmesini sağlamak için üretim tesisleri genelinde standart yayın önerimlerinin kullanımı yer alır.

 

 

9. BÖLÜM: Off-the-Shelf Allogenik CART Hücreler veya Diğer İmmun Effektör Hücreler

Stephane Depil ve Waseem Qasim

"Off-the-shell" allogenik CAR TCRa43 T hücreleri ve doğal katil (NK) veya gama delta (gd) T hücreleri gibi diğer immün efektör hücreleri, sağlıklı donörlerden üretilebilir ve otolog stratejilerine alternatif sunabilir.

Graft Versus Host Hastalığından (GvHD) korunmak için stratejiler

Genome Edited afITCR-Deleted T Cells

TCRal3 etkinliğini azaltma stratejileri, kesilmiş baskın-negatif CDX proteinlerinin (Gilham ve d. 2018), protein ifade engelleyici (PEBLs) (Kamiya ve d. 2018), küçük saç pimi RNA (Bunse ve d. 2014) ve genom düzenleme. İkinci platformlarda çinko-parmak çekirdekleri (ZFN) homing endonükleaz/meganükleazlar, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör çekirdekleri (TALEN), megaTALs, düzenli olarak aralıklı kısa palindromik yineleme (CRISP/cas9) ve taban editörleri (BEs) (Depil ve d. 2020) bulunmaktadır. TALENs (Servier/Allogene) kullanılarak üretilen evrensel TCR-depleted CAR19 T hücreleri (Qasim et al. 2017; Benjamin ve d. 2020) ve meganükleazın ilk uygulamaları yayımlandı.

(Precision Bio) ve CRISPR mühendisliği yakın zamanda rapor edilmiştir. (CRISPR Terapötikleri). Üretim adımları, anti-CD3 / CD28 antikorları ile sağlıklı donör T hücresi aktivasyonunun ortak yönlerini paylaşır, nükleazların elektroporasyonu ve CAR transgeninin viral vektör iletimi ile düzenlenir. Manyetik boncuklu kolon kullanılarak kalan TCRoc0 T hücrelerinin tükenmesi, potansiyel olarak allore-aktif T hücrelerinin taşıyıcının GvHD'ye yol açabilecek eşiğin altında tutulmasını sağlar.

Virus-Spesifik T (VST) Hücreler

Üçüncü taraf, bağışçıdan türetilen VST hücreleri, allogeneik SCT'de araştırılmış ve muhtemelen kısıtlı, virüse özel, repertoire ve bellek T hücre fenotürü nedeniyle daha düşük düzeyde GvHD'ye neden olmuş gibi görünmektedir. Örnekler, CAR19'u (Curran ve d. 2011) ve anti-CD30 CAR'yi (Savoldo, 2007) ifade etmek üzere dönüştürülmüş allojenik EBV'ye özgü T hücrelerini içerir.

Alternatif Immün Efektör Hücreler

CAR 19'u eksprese etmek için lentiviral transdüksiyon yoluyla modifiye edilmiş NK hücreleri de dahil olmak üzere GvHD'nin uyarılması ile ilişkili olmayan immün efektör hücreler, CLL'de erken faz etkinliği sergilemiştir (Liu ve d. 2020). Benzer şekilde, iNKT veya y8T hücrelerinin katı tümörlere karşı avantajları olabilir, ancak klinik deneyim hala sınırlıdır (Gentles ve d. 2015). Antitümör özelliklere sahip CAR makrofajlarının mühendisliği de yakın zamanda tanımlanmıştır (Klichinsky ve d. 2020).

Allojenik Bağışıklık Hücrelerinin Konak Aracılı Reddedilmesini Önleme Stratejileri

Üçüncü taraf donör hücre bankalarının kısmi HLA eşleşmesinin ötesinde, konak aracılı ret riskini ele almak için iki ana strateji vardır.

Lenfodeplesyon ve İmmünsüpresyona Karşı Direnç

CAR-T hücreleri, CD52'nin bozulması yoluyla bir anti-CD52 monoklonal antikoruna dirençli hale gelecek şekilde genomu düzenlenmiştir (Benjamin ve d. 2020). Bu yaklaşım, T, B ve NK hücreleri gibi reddetmeye aracılık edebilen tüm CD52+ bağışıklık hücrelerini baskılama avantajına sahiptir, ancak uzun süreli bağışıklık bastırma, daha yüksek ciddi virüs yeniden etkinleştirme riski ile ilişkilidir. Kalsinörin inhibitörlerine direnç kazandırmak için mühendislik stratejileri de kullanılmıştır. Üretim adımları, elektroporasyon sırasında TCR lokusunun düzenlenmesiyle birlikte çoğullanabilir veya vektör tasarımına eklenebilir ve transdüksiyon adımlarına dahil edilebilir.

Konak İmmünitesinden Kaçmak İçin HLA’nın Kaldırılması

Hücre yüzeyindeki sınıf I HLA’nın CD8+ T hücre-aracılı reddi ortak beta-2-mikroglobulin genini bozundurarak gerçekleştirilebilir. Bu teşebbüs, CAR19 T hücrelerinin (CRIS PR Tx) çoğullu düzenlemesi aracılığıyla halen araştırılıyor. Teoride, HLA sınıf I moleküllerinin tamamen eksik olması ‘kendinin kaybı’ (missing self hypothesis) cevabına karşı doğal katil(NK)-aracılı  reddi arttırabiliyor; ve pratikte, HLA-E gibi non-polimorfik HLA molekülleriyle önlenebilir. Aktive olmuş T hücrelerinde HLA sınıf II tanınmasının reddi, CIITA ve RFXANK gibi kritik transkripsiyon faktörlerinin bozunmasına bağlı olabilir. (Depil et al. 2020).

'Off-the-Shelf' CAR’lerin Üretilmesi

‘Off-the-shelf’ T hücresi terapilerinin ekseriyeti; sabit-durumdaki lökoferez aracılığıyla, tam kan ve umbilikal kordon kanı gibi alternatif kaynakların uyumlu olabilmesine rağmen, periferal kan mononükleer hücreleri sağlıklı donör sağlamıştır. Gelecekte, immün efektör hücreleri uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden (iPSC) de türetilebilir. Teorik olarak, esas bir iPSC hücre hattı sınırsız bir kendini yenileme yeteneğine sahiptir ve depolabilerek süresiz bir şekilde kullanılır. Genelde uygun lisanslı ve yasal onaylı GMP şartları altında temiz oda ayarında manipülasyonlar görülebilir. Çoğu hücre gen transferi ve genom mühendisliği stratejileri açık kromatin ve ulaşılabilir DNA sağlamak için mitoz bölünme aktifliğini gerektirir ve aktivasyon adımları erken çoğalma sürecinde hayatidir. Kapalı sistem kültürü ve genişleme işgücünü azaltan otomasyonlarla artık sıradanlaştı. Genom düzenlenmesi ve stabilize mRNA’nın tedariği için yüksek kalite viral vektör sunumları ve geliştirilmiş elektroforez adımları kritikleşmiştir. Uygun dozda formülasyonlarda ve verimli soğutma altında kriyoprezerv (dondurarak saklama) ve depolama üretim öncesi ‘off-the-shelf’ terapilerinin başlıca bileşenlerinden biridir.

Önemli Noktalar

•              Önemli GvHD potansiyelinden yoksun Off-the-shelf allojenik CAR-T hücreleri üretilebilir.

•              α-β TCR-silinmiş CAR-T hücreleri ve CAR NK hücreleri, erken klinik deney fazına başarılı bir şekilde girdi.

•              Konak aracılı allojenik efektör hücre reddini önlemek için birçok strateji geliştirildi.

 

ÇEVİRENLER :

İkra AKAGÜNDÜZ

İrem Sude ŞAHİN

Merve ÇAŞKA

Nisa Nur AKGÜL

Pınar YENİLMEZ