İnsan akciğer gelişiminde yer alan genlerin ve mikroRNA'ların keşfi, IGFBP3/miR-34a dinamiklerini ve bunların alveoler farklılaşma açısından önemini ortaya koyuyor.
Melissa Acosta‑Plasencia1†, Joan J. Castellano1,2†, Tania Díaz1, Yangyi He1,3, Ramón M. Marrades4,5,6,7 and Alfons Navarro1,4,5
Özet
Arka Plan
İnsan akciğer gelişiminin psödoglandüler evresinde ilkel bronşiyal tomurcuklar başlangıçta mezenşimle çevrili endodermden türetilen epitel ile kaplı basit tübüllerden oluşur ve bu tübüller giderek hava yollarına dallanır ve distal epitel kesecikleri oluşturmaya başlar. İlk kez alveolar tip II (AT2) pnömositler bu evrede ortaya çıkar. Bu çalışmanın amacı, bu farklılaşma sürecinde rol oynayan genleri ve mikroRNA’ ları karakterize etmek ve alveolar farklılaşmanın başlamasındaki rolünü çözmektir.
Yöntemler
İnsan embriyonik akciğerlerinde, postkonsepsiyon 7. ve 12. gebelik haftaları arasında gen ve mikroRNA profillemesi yapıldı. Aday genlerin protein ekspresyon lokasyonları embriyonik akciğer doku kesitlerinde immünofloresan yöntemi ile analiz edildi. mRNA/miRNA hedef çiftleri hesaplamalı yaklaşımlar kullanılarak tanımlandı ve bunların ekspresyonu saflaştırılmışepitel/mezenkimal hücre popülasyonlarında ve bronş ağacından izole edilen uç ve saplarda incelendi. Ayrıca, insan embriyonik akciğer mezenkimal hücrelerinde ve insan embriyonik uçtan türetilen akciğer organoidlerinde susturma deneyleri ve aynızamanda organoid farklılaşma çalışmaları gerçekleştirildi. AT2 hücre belirteçleri qRT-PCR ve immünofloresan ile incelendi. TGFB‑β fosforile edilmiş yollar membran protein dizileriyle analiz edildi. Akciğer eksplantları hava/sıvı arayüzünde peptitli/peptitsiz kültüre edildi.
Bulgular
IGFBP3 de dahil olmak üzere 88 farklı şekilde ifade edilen gen belirlendi. Her ne kadar IGFBP3 mRNA hem epitel hem de mezenkimal popülasyonlarda saptanmış olsa da proteinin yalnızca epitelde bulunduğu görüldü. Bu durum post-transkripsiyonel düzenlemenin mezenşimde IGFBP3 protein ekspresyonunu engellediğine işaret ediyordu. miRNA profillemesi miR‑34a'yı bir IGFBP3 düzenleyicisi olarak tanımladı. miR‑34a mezenkimal hücrelerde upregüle edildi ve insan embriyonik akciğer mezenkimal hücrelerinde susturulması IGFBP3 seviyelerini artırdı. Ayrıca IGFBP3 ekspresyonu postkonsepsiyon 7. ve 12. haftalarda uyarana verilen tepkide belirgin bir azalma olduğunu gösterdi, bu da onun farklılaşma sürecinde rol oynadığınıdestekler nitelikteydi. İnsan embriyonik uçtan türetilen akciğer embriyonik organoidlerinin farklılaşması, IGFBP3'te ciddi bir azalma gösterdi ve bu da scRNAseq verileriyle desteklendi. Organoidlerde IGFBP3 susturulması, kök hücre belirteçlerinin downregülasyonu ve AT2 belirteçlerinin upregülasyonu ile karakterize alveoler benzeri bir farklılaşma sürecini aktive etti. Bu süreç TGFβ sinyal iletiminin inhibisyonu ve BMP yolağının aktivasyonu aracılığıyla gerçekleşmektedir.
Sonuç
IGFBP3/miR‑34a ekseni, embriyonik farklılaşmamış akciğer epitelinde IGFBP3 ekspresyonunu sınırlar ve psödoglandüler evredeki IGFBP3'ün ilerleyici downregülasyonu , alveoler farklılaşma için gereklidir.
( Anahtar Kelimeler İnsan akciğer embriyogenezi, IGFBP3, miR‑34a, Organoidler, Mezenşim, Epitelyum, Uçlar, Saplar, Alveolosferler )
Grafiksel Özet
Arka Plan
İnsan akciğer gelişimi, döllenmeden sonraki 3–4. haftalarda (post conception weeks, pcw) başlar ve temel histolojik değişikliklere göre beş aşamaya ayrılabilir:
1. Embriyonik aşama (3–4 ila 6–8 pkh)
2. Psödoglandular aşama (6–8 ila 16 pkh)
3. Kanaliküler aşama (16 ila 26–28 pkh)
4. Kesecik aşama (26–28 ila 32–36 pkh)
5. Alveolar aşama (32–36 pkh'den 2–4 yaşına kadar)
Psödoglandüler evre sırasında, bronşiyal tomurcuğun dallanmasının kademeli süreci ardışık hava yolu nesillerinin oluşumuna yol açar. Histolojik olarak, erken psödoglandüler evrede, ilkel bronşiyal tomurcuklar bol miktarda gevşek mezenşimle çevrili, kalın bir endoderm kökenli epitel tabakasıyla kaplı basit tübüllerdir [1, 4]. Bu bronşiyal tomurcuklar ilerleyici dallanmaya uğrar ve bu da başlangıçta yalancı çok katlı epitel ile karakterize edilen ve yaklaşık postkonsepsiyon 12. haftada (geç psödoglandüler evre) basit silindirik solunum epiteli ile kaplanan hava yolu nesillerinin artmasıyla sonuçlanır [4, 5]. Daha sonra epitel hücreleri, basit bir kılcal ağ örtülü mezenşim tarafından çevrelenmiş silli hücrelere, kadeh hücrelerine ve bazal hücrelere farklılaşacaktır [6]. Bu epitel, bu basit tübüllere "psödoglandüler" bir görünüm kazandıran belirgin subnükleer vakuolizasyon ile dikkat çekmektedir [1].
Moleküler düzeyde, çok sayıda çalışma, mezenşim ve farklılaşmamış epitel arasındaki parakrin sinyal koordinasyonunun normal hücre farklılaşması ve akciğer morfogenezi için önemini göstermiştir [7–10]. Çoğu çalışma hayvan modelleri üzerinde gerçekleştirilmiş olsa da, yakın zamanda insan akciğer gelişiminde önemli farklılıklar bildirilmiştir [9, 11] ve organoid çalışmaları moleküler yolların rolünü doğrudan insan örneklerinde çözmeye başlamıştır [12–14]. Tek hücreli RNAseq, epitel farklılaşmasında proksimal-distal bir gradyanın ve mezenkimal kompartımanda farklı sinyal etkileşimlerine sahip farklı niş bölgelerinin varlığını vurguladı [15–18].
Bu gelişmelere rağmen, insan embriyonik örnekleri kullanan çalışmaların sayısı sınırlı kalmaya devam ediyor. Ek olarak, gebelik yaşı ölçümündeki farklılıklar veya bireyler arası farklılıklar nedeniyle örnekler arasındaki değişkenlik, işlevsel çalışmalar yoluyla daha fazla araştırma ve doğrulama gerektiriyor. Dahası, birçok sinyal ağı, özellikle mikroRNA'lar (miRNA'lar) dahil olmak üzere kodlamayan RNA'ların insan akciğer gelişimini düzenlemedeki rolü kapsamlı bir şekilde incelenmemiştir [4, 19, 20]. miRNA'lar, esas olarak haberci RNA'nın (mRNA) proteine translasyonunu bloke ederek veya onu bozarak hedef genlerinin transkripsiyon sonrası ekspresyonunu negatif olarak düzenleyen, kodlamayan küçük RNA molekülleridir (22-24 nükleotit uzunluğunda). Dahası, kök hücre regülasyonunda önemli bir rol oynadıkları tanımlanmıştır [23, 24]. Akciğer gelişimindeki miRNA profili çalışmalarının çoğu, sıçanlarda [25, 26] veya fare fetal akciğerlerinde [27-29] gerçekleştirilmiştir; çok azı insan embriyonik örneklerinde yapılmıştır [4, 27, 30].
İnsan akciğerinin düzgün gelişimi için epitel hücreleri ve çevreleyen mezenşim arasındaki koordinasyon esastır. Akciğerin hücre farklılaşmasında ve morfolojik gelişiminde çok sayıda molekül rol oynar, bunlar SOX2 ve SOX9 genleri, TGFβ ailesi ve WNT yolağıdır. İnsülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein (IGFBP) ailesi, hücre çoğalmasını, farklılaşmasını ve hayatta kalmasını düzenleyen insülin benzeri büyüme faktörlerini (IGF'ler) bağlayabilen ve regüle edebilen altı salgılanmış proteinden (IGFBP1-IGFBP6) oluşur [31]. IGFBP3, dolaşımdaki en bol IGFBP'dir ve rahim, meme bezi ve plasentada bulunabilir [32]. Olgun IGFBP3 proteini yetişkin bir insanda hem IGF'ye bağımlı hem de bağımsız bir şekilde hareket ederek çok sayıda önemli rol oynar. TGFβ/Smad sinyalizasyonuna müdahale ettiği, hücre çoğalmasını engellediği ve apoptozu indüklediği bilinmektedir [33, 34]. IGFBP3, lokal ve distal iletişime katılabilen çözünür bir proteindir [35], bu da onun gelişimle ilgisini vurgulamaktadır. Her ne kadar çoğu çalışma çözünür IGFBP3'ün rolüne odaklanmış olsa da, hücresel IGFBP3 için kök hücrelik ve farklılaşma süreçlerinin kontrolü de dahil olmak üzere farklı işlevler tanımlanmıştır [36, 37].
Mevcut çalışmada, insan embriyonik akciğerlerini postkonsepsiyon 8.-12. haftadaki gelişiminde inceleyerek insan psödoglandüler evresinde farklılaşma sürecinde yer alan genleri ve miRNA'ları araştırıldı.
İnsan Embriyonik Örnekleri
Çalışmada, 25 adet klinik olarak düşükle sonuçlanan embriyo ve fetüsler kullanıldı.Tüm örnekler, Üniversiteye bağışlanmış ve yasal izinler çerçevesinde kullanılmıştır.Örneklerin kullanımı için, Barselona Üniversitesi Biyoetik Komisyonu tarafından onay alınmıştır (Proje numarası: IRB00003099).
Çalışma kapsamında, 7 ila 13 gebelik haftaları (pcw) arasındaki insan embriyonik akciğerleri analiz edilmiştir.Örnekler, Olympus SZ61 stereomikroskop kullanılarak kontrol altında alınmış ve hazırlanmıştır
RNA Ekstraksiyonu
Toplam RNA, Trizol reaktifi (Invitrogen) kullanılarak üretici firmanın talimatlarına uygun şekilde izole edilmiştir.RNA konsantrasyonu, NanoDrop 1000 spektrofotometre kullanılarak ölçülmüştür.RNA kalitesi, Agilent 2100 Bioanalyzer ile RNA 6000 NANO kiti kullanılarak değerlendirilmiştir.RIN değeri 8’den büyük olan örnekler sonraki analizlere dahil edilmiştir.
mRNA Profilleme
6 embriyonik akciğer örneği ve 3 normal erişkin akciğer dokusu kullanılmıştır.Affymetrix GeneChip Human Gene 2.1 ST array kullanılarak gen ekspresyon analizi yapılmıştır.Biyoinformatik analizler, R yazılımı (versiyon 4.1.1) ve Bioconductor paketleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.Arka plan düzeltme, filtreleme ve normalizasyon, oligo paketinden (Bioconductor) sağlam çoklu dizi analizi (RMA) yöntemi ile gerçekleştirildi.Diferansiyel gen ekspresyon analizi, limma paketi kullanılarak yapılmıştır.Gen Ontoloji (GO) zenginleştirme analizi, topGO paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
miRNA profillemesi
miRNA ekspresyon analizi daha önce de açıklandığı gibi, 758 miRNA içeren TaqMan® Dizi İnsan MikroRNA Seti Kartları v2.0 (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts, ABD) [38] kullanılarak gerçekleştirildi. Gerçek zamanlı kantitatif PCR reaksiyonları, bir ABI 7900 HT Dizi Algılama Sistemi (ThermoFisher) üzerinde gerçekleştirildi.
Bağıl miRNA ekspresyonu 2−ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı. Normalizasyon, RNU6B, RNU24, RNU43, RNU44, RNU48 ve RNU6 dahil olmak üzere çeşitli endojen kontrollerin stabilitesini karşılaştıran ön analizlere dayanarak miR-191 ile gerçekleştirildi.MammU6 ve potansiyel endojen miRNA'lar; miR-191 en düşük değişkenliğe sahipti. Kalibratör örneği olarak, yetişkin bir akciğer normal dokusunun ortalama miRNA değerini kullandık. Numunelerin %10'undan daha azında veya güvenilmez bir niceleme ile eksprese edilen tüm miRNA'lar, daha fazla analizden çıkarıldı ve geriye 257 miRNA'lık nihai bir çalışma seti kaldı.
miRNA hedef tanımlama
Daha önce gerçekleştirildiği gibi potansiyel miRNAmRNA çiftlerini tanımlamak için RmiR paketi (Bioconductor versiyon 2.6) kullanıldı [38]. RmiR kullanarak, TargetScan (http://www.targetscan.org/) veritabanından tahmin edilen hedeflere dayalı olarak, DEG mRNA gelen ifade verileri, aynı embriyonik örneklerdeki (n = 6) tüm miRNA ifade verileriyle çapraz ilişkilendirildi . Minimum negatif korelasyonu -0.4 olan tanımlanan mRNA/miRNA çiftleri, gerçek zamanlı PCR ile tek miRNA ve miRNA testleri kullanılarak mevcut tüm embriyonik örneklerde (n = 22) doğrulandı.
İmmünfloresan Analizler
Formalin ile sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku kesitleri şu şekilde ön işleme tabi tutuldu: 5 μm kalınlığındaki doku kesitleri Dako Silanized Slides (Dako, Glostrup, Danimarka) üzerine monte edildi. Mum alma ve antijen alımı için, bölümler manuel olarak Hedef Alma çözeltisine (S1699, Dako) daldırıldı ve Dako PT Link cihazında 20 dakika boyunca 95-99 ° C'de ısıtıldı. Daha sonra sıcaklığın 65 ° C'ye kadar düşmesine izin verildi ve daha sonra slaytlar PBS'de oda sıcaklığında (RT) her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkandı.Kültürlenmiş mezenkimal hücreler aşağıdaki gibi ön işleme tabi tutuldu [10]: lameller üzerine ekilen hücreler, RT'de DPBS'de% 4 paraformaldehit içinde sabitlendi, ardından Triton X-100'ün% 0.5'i ile geçirgenlik gösterdi (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, ABD) RT'de 5 dakika boyunca DPBS 1x'te (PBTx).Hem FFPE hem de Sabit kültürlenmiş hücreler daha sonra RT'de 60 dakika boyunca PBTx'te% 1 Sığır Serum Albümini (BSA) (Sigma-Aldrich) ve% 5 Normal Eşek Serumu (NDS) (Sigma-Aldrich, Sant Luis, Missouri, ABD) ile bloke edildi. Daha sonra, karanlıkta 4 ° C'de gece boyunca bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş birincil antikorlarla (Tablo S1) inkübe edildiler.
Primer antikor yıkamasından sonra (3 × 5 dk PBS), PBTx %0.1'de %5 NDS içinde seyreltilmiş ikincil antikorlar (Tablo S1) karanlıkta RT'de 2 saat inkübe edildi. Son olarak, numuneler boyandı ve DAPI (Sigma-Aldrich) ile Fluoroshield kullanılarak mikroskop slaytlarına monte edilmiştir.İmmünofloresan analizi Olympus BX51 Floresan Mikroskobu (Olympus, Tokyo, Japonya) kullanılarak yapıldı ve hücre görüntüleri DPController ve DPManager yazılımı (Olympus) ile elde edildi.
Epitel ve Mezenkimal Zenginleştirilmiş Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu
Fetal akciğer örnekleri bir neşter kullanılarak mekanik olarak ayrıştırıldı ve Kollajenaz/Dispas kullanılarak enzimatik olarak ayrıştırıldı (Cat N. 10,269,638,001, Roche; Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, ABD) (37 °C'de 45 dakika) ve Tripsin-EDTA (%0,25), fenol kırmızısı (Cat N. 25,200,056, Life Technologies) (37 °C'de 10 dakika). Daha sonra örnekler 15 mL'lik bir tüpe yüklendi ve 10 dakika ajitasyon boyunca DMEM ve DNaz I (10 mL DMEM + 13.5 μl DNaz I) ile inkübe edildi. Hücre kümelerini çıkarmak için, numuneler 100 μm ve 40 μm'lik bir filtre kullanılarak filtrelendi. Filtrelenen numuneler 4 °C'de 550 g'da 5 dakika santrifüj edildi ve hücre peleti 1 mL Tampon (PBS, pH 7.2, %0.5 BSA, 2 mM EDTA) ile yıkandı ve 1.5 mL'lik bir tüpe aktarıldı. Daha sonra, hücreler 4 ° C'de 550 g'da 5 dakika santrifüj edildi ve hücre peleti 300 μl Tampon içinde yeniden süspanse edildi. Hücre sayımından sonra, daha sonraki işlemler için 5 × 107 hücre kullanıldı.
Manyetik etiketlemeyi gerçekleştirmek için, hücreler 100 μl FcR Bloke Edici Reaktif, insan (Miltenyi Biotec, Köln, Almanya) ile karıştırıldı. Daha sonra 100 μl CD326 (EpCAM) Mikroboncuklar (Miltenyi Biotec) ilave edildi ve 4 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edildi. İnkübasyondan sonra 1 mL Tampon ilave edildi ve numuneler 300 g'da 10 dakika santrifüj edildi. Hücre peleti 500 μl tampon içinde yeniden süspanse edildi.Manyetik ayırmaya devam etmek için, MS sütunları (Miltenyi Biotec) manyetik alana yerleştirildi ve 500 μl Tampon ile hidratlandı. Kolona hücre süspansiyonu uygulandı ve EPCAM hücrelerini (mezenkimal zenginleştirilmiş popülasyon) içeren akışı topladık. Daha sonra MS kolonu 500 μl Buffer ile üç kez yıkandı.
Son olarak MS kolonunu manyetik alandan çıkardık ve kolonu 1.5 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirdik. Daha sonra EPCAM + hücrelerini (epitelyal zenginleştirilmiş popülasyon) geri kazanmak için 500 μl tampon eklendi.
mRNA ve Tekli miRNA Miktar Tayini
mRNA ve miRNA'lar, TaqMan tahlilleri kullanılarak daha önce tarif edildiği gibi ölçüldü (kullanılan diziler Tablo S1'de gösterilmiştir) [39, 40].
Akciğer Mezenkimal Hücrelerinin Kültürü ve Transfeksiyonu
İnsan embriyonik akciğer mezenkimal hücreleri, EPCAM± mikroboncuk saflaştırması sonrasında elde edilen mezenkim açısından zengin popülasyonun kültüründen elde edildi ve daha önce tarif edildiği şekilde kültüre edildi [10].
Transfeksiyondan bir gün önce, 6 kuyucuklu plaklara 7 × 10⁴ hücre ekildi. Ertesi gün, hücreler 200 nM miR-34a-ASO (5′-ACAACCAGCTAAGACACTGCCA-3′) veya ASO kontrolü (5′-GATACCAGGGACATACGCTTGATCCTAGC-3′) ile Lipofectamine 3000 (Life Technologies)kullanılarak transfekte edildi.
24 saatlik inkübasyonun ardından, miR-34a seviyeleri ölçülerek miR-34a inhibisyonunun düzgün gerçekleştiği doğrulandı.
İnsan Embriyonik Akciğerlerinden Uç ve Sap Bölümlerinin Elde Edilmesi
İnsan embriyonik akciğer lobları, Dispase II 8U/mL (D4693, Merck Millipore) içinde buz üzerinde 30 dakika inkübe edildi, ardından oda sıcaklığında 15 dakika orbital mikserde karıştırıldı.
Mezenşim, sterilize edilmiş oftalmik mikrocerrahi aletler ve tungsten iğneler kullanılarak stereoskopik mikroskop altında ayrıldı. Uç ve sap bölgeleri, dallanma ucunun en uç kısmı ve sap bölgesinin daha proksimal kısmı kesilerek izole edildi (Şekil 5a gösterildiği gibi).
Elde edilen uçlar, organoid kültürü için; uç ve sap bölgeleri ise RNA saflaştırması için işlendi.
Organoid Kültürü
İnsan embriyonik akciğer organoidleri, akciğer uçlarının kültüründen elde edildi. Elde edilir edilmez, uçlar soğuk sıvı Matrigel’e (Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Corning, NY, USA) transfer edildi. Daha sonra, uçları içeren 30 μL Matrigel, 12 kuyucuklu bir plaka içine yerleştirildi.
Plaka, Matrigel’in polimerize olup katılaşmasını sağlamak için 37 °C’de 30 dakika inkübe edildi. Ardından, her kuyucuğa 1000 μL organoid ortamı eklendi ([13]’e göre hazırlandı).
Organoid ortamı şu bileşenleri içeriyordu:
-Advanced DMEM/F12 (ThermoFisher)
-Amfoterisin B (2.5 μg/mL, ThermoFisher)
-1× Glutamax (ThermoFisher)
-1× N2 supplement (ThermoFisher)
-1× B27 supplement (ThermoFisher)
-%0.05 BSA (Sigma-Aldrich)
-%2 Penisilin-Streptomisin (PS) (ThermoFisher)
-FGF7 (10 ng/mL, Stemcell Technologies, Grenoble, Fransa)
-CHIR99021 (3 μM, Stemcell Technologies)
-Retinoik Asit (50 nM, Stemgent, Cambridge, Massachusetts, ABD)
-Askorbik Asit (50 μg/mL, Sigma-Aldrich)
-1-Tiogliserol (0.4 μM, Sigma-Aldrich)
Plaka, standart doku kültürü koşullarında (37 °C, %5 CO₂) inkübe edildi. Uçlar, ilk pasaj öncesinde düzenli bir büyüme deseni sergiledi ve daha sonra küresel bir yapı kazandı (Şekil S1).Farklı deneylerde kullanılan organoidler, 3. veya 4. pasajda elde edildi.
Organoid Farklılaşması
İnsan embriyonik akciğer ucu kaynaklı organoidleri proksimal hava yollarına farklılaştırmak için, organoid ortamı plakadan uzaklaştırıldı ve yerine 1000 μL insan hava yolu farklılaştırma ortamı (PneumaCult™, Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Kanada) eklendi.
Organoidler, standart kültür koşullarında (37 °C, %5 CO₂) 5 hafta (pkh) boyunca bu ortamda büyütüldü.
Organoidlerin Geri Kazanımı ve Parafin Gömme İşlemi (İmmünofloresan Çalışmaları İçin)
1. Matrigel’den Organoidlerin Ayrılması
Kuyucuktaki organoid ortamı aspire edildi.1 mL soğuk Advanced DMEM/F12 ortamı kullanılarak Matrigel damlası ayrıldı.
Matrigel damlası (organoidler ile birlikte) 15 mL’lik bir tüpe transfer edildi.Organoidleri Matrigel’den ayırmak için 10 mL soğuk DMEM/F12 ile 3 kez yıkama yapıldı.
2. Organoidlerin Temizlenmesi ve Sabitlenmesi
Organoidler, 1 mL Corning Cell Recovery Solution (Corning, NY, USA) ile tekrar yıkandı.Buz üzerinde 30 dakika inkübe edildi, inkübasyon sırasında 15. dakikada tüp ters çevrildi.Daha sonra organoidler soğuk DPBS ile yıkandı ve 200g’de 5 dakika, 4 °C’de santrifüj edildi.
Süpernatant uzaklaştırıldı ve organoidler %4 paraformaldehit içinde oda sıcaklığında 30 dakika fikse edildi.
3. Parafin Gömme İçin Hazırlık
Organoidler 3 kez DPBS ile yıkandı.200g’de 5 dakika, 4 °C’de santrifüj edildi ve pelet 100 μL Histogel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) içinde 45 dakika (veya katılaşana kadar) bekletildi.
Histogel içine yerleştirildikten sonra,%70, %80, %95 ve %100 etanol sıralı kademeli olarak kullanılarak dehidrasyon işlemi uygulandı.Ksilen işlemi yapıldı.Son olarak parafin gömme işlemi tamamlandı.
Organoid Nükleofeksiyonu
1. Organoidlerin Dağılması ve Hazırlanması
Organoidler ([14]’e göre kültüre edilmiş) cam Pasteur pipetleri kullanılarak mekanik olarak parçalandı.
Hücre sayımı yapıldıktan sonra, 2×10⁵ hücre Lonza P3-Primary Cell Nucleofection Solution içinde süspanse edildi.
1 μL IGFBP3 DsiRNA (Design ID: hs.Ri.IGFBP3.13.1) veya Negatif Kontrol DsiRNA (IDT, Coralville, Iowa) eklendi.
2. Nükleofeksiyon İşlemi
Hazırlanan hücre süspansiyonu 100 μL’lik nükleofeksiyon küvetine (V4XP-3012, Lonza, Basel, İsviçre) transfer edildi.Lonza 4D Nucleofector cihazı X ünitesi ile EA125 programı kullanılarak nükleofeksiyon gerçekleştirildi.
3. Nükleofekte Edilen Hücrelerin Kültüre Edilmesi
Nükleofeksiyon sonrası, 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü, ROCKi, 72304, StemCell) içeren organoid kültür ortamı nükleofeksiyon küvetine eklendi.
Hücre karışımı geri kazanıldı, Matrigel içine ekildi ve 24 kuyucuklu bir plakaya dağıtıldı.Hücreler, 10 μM ROCKi içeren organoid kültür ortamında kültüre edildi.
4. Görüntüleme ve RNA Ekstraksiyonu
Hücrelerin 48 saat boyunca canlı hücre görüntüleme sistemi (EzScope 101, Blue-Ray Biotech, New Taipei City, Tayvan) ile sıralı görüntüleri alındı.48 saat sonra RNA ekstraksiyonu gerçekleştirildi.
IGFBP3 ile Akciğer Eksplant Kültürü
Küçük insan embriyonik akciğer parçaları, kültür ortamı üzerine asılmış Nucleopore Track-Etch membranının (Whatman, Florham Park, NJ) üstüne yerleştirildi.Kültür ortamı olarak D-MEM/F12 + Penisilin/Streptomisin içeren medium kullanıldı.Ortama, 50 nM Rekombinant İnsan IGFBP3 Proteini (Aktif) (ab280941, Abcam, Cambridge, UK) veya PBS (Kontrol) eklendi.
Akciğer eksplantları, 37 °C, %5 CO₂ içeren hücre inkübatöründe 2 gün boyunca kültüre edildi.Kültür süresi sonunda örnekler formalinle fikse edildi ve histolojik analiz için parafine gömüldü.
Protein Dizileri
C-Serisi İnsan TGF beta Yolu Fosforilasyon Dizisi C1 ( AAH-TGFB-1, RayBiotech, Georgia, ABD), ATF2 (P-Thr69/71), c-Fos (P-Thr232), c-Jun (P-Ser73), SMAD1 (P-Ser463/465), SMAD2 (P-Ser245/250/255), SMAD4 (PThr277), SMAD5 (P-Ser463/465) ve TAK1 dahil olmak üzere TGFβ/Smad sinyalinden 8 fosforlu insan proteinini değerlendirmek için kullanıldı
-Organoidler, kontrol veya IGFBP3 siRNA ile daha önce açıklanan şekilde nükleofekte edildi.24 saat sonra toplam protein saflaştırıldı.
-Analiz için 50 µg toplam protein kullanıldı.
-Protein array inkübasyonu ve protein tespiti, üretici firmanın protokolüne göre gerçekleştirildi.
-Kemilüminesans tespiti, ChemiDoc (Bio-Rad, California, USA) cihazında yapıldı.
-Protein kantifikasyonu, Quantity One yazılımı (v4.6.3, Bio-Rad) kullanılarak ölçüldü.
-Toplamda 6 protein array (3 bağımsız replikata karşılık gelecek şekilde) kullanılarak, kontrol ve IGFBP3 siRNA ile transfekte edilen organoidler arasındaki farklılıklar analiz edildi.
Alveolar Organoidler Üzerinde Tek Hücre RNA-Seq Verilerinin In Silico Analizi
Kontrol ve alveoler farklılaşmış organoidlere ait tek hücre RNA-Seq verileri, [12] kaynağından elde edildi.
IGFBP3 ekspresyon seviyeleri ve hücre popülasyonlarındaki hücresel lokalizasyonu, CELLxGENE portalı kullanılarak analiz edildi [41]. Verilere CELLxGENE portalı üzerinden erişilebilir.( at https://fetal-lungorganoid.cellgeni.sanger.ac.uk/. )
İstatistiksel analiz
İki grup örneklem arasındaki karşılaştırmalar için Ttestleri veya uygun olduğunda U-Mann Whitney, ikiden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar için ANOVA testi kullanıldı. mRNA ve miRNA ekspresyonunu ilişkilendirmek için Pearson korelasyonu kullanıldı. Tüm transfeksiyon deneyleri için Kontrol ve durumu karşılaştırırken, bir T-testi analizi kullanıldı. Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism 9 (La Jolla, CA, ABD) veya R programı sürüm 4.1.1 kullanılarak yapıldı.
Sonuçlar
İnsan Akciğeri Gelişiminin Erken ve Geç Pseudoglandüler Aşamasından Farklılaşan mRNA Ekspresyonunun Analizi
İnsan embriyonik akciğer gelişiminin 8 ile 12 hafta arasındaki (pkh) farklılaşma sürecinde yer alan genleri belirlemek amacıyla, 9 akciğer örneği üzerinde ekspresyon dizileri gerçekleştirildi. Bu örnekler, üç 8-9 pkh, üç 12 pkh embriyonik akciğer ve üç insan yetişkin dokusu içeriyordu.
Hiyerarşik kümeleme yöntemi, tüm mRNA ekspresyonuna dayalı olarak iki belirgin grup ortaya koydu: yetişkin dokuları ve embriyonik dokular. Embriyonik dokulara odaklanıldığında, erken pseudoglandüler aşama (8 ve 9 pkh örnekleri) ile geç pseudoglandüler aşama (12 pkh örnekleri) açıkça birbirinden ayrıldığı görüldü (Fig. 1a).
Ana bileşenler analizi (PCA) bu gözlemi güçlendirdi ve grafikte soldan sağa doğru üç ana grup ayrıldı (Boyut 1, varyansın %47,8'ini açıklarken, Boyut 2 varyansın %24,7’sini açıklıyor; Boyut 1 vs Boyut 3, varyansın %6,5'ini açıklıyor): Yetişkin dokuları, 12 pkh, ve 8-9 pkh embriyonik akciğerleri (Fig. 1b).
Farklılaşan gen ekspresyonu analizi (p<0.001; Tablo S2), 8-9 pkh örnekleri ile 12 pkh örnekleri arasında 88 farklı ekspresyon gösteren gen (DEG) tespit etti. Fig. 1c, DEG'nin tüm analiz edilen örneklerdeki ekspresyonunun bir ısı haritasını göstererek, DEG'nin yetişkin dokudaki ekspresyon eğilimlerini de gözler önüne serdi.
String analizi, bu 88 DEG arasında etkileşim ağı belirlemek için yapıldı. 52 genin (%59.1) diğer genlerle etkileşimde olduğu saptandı. K-means analizi, MYC tarafından bağlantılı iki ana gen kümesinin bulunduğunu gösterdi (Fig. 1d).
Gene Ontology (GO) terimleri için yapılan analiz (Fig. 1e ve Tablo S3), en belirgin şekilde zenginleşen GO terimlerinin "anyon", "iyon" ve "organik madde" taşınımı ile ilgili olduğunu gösterdi (GO:0006820, GO:0006811, GO:0071702). İlginç bir şekilde, ayrıca nöron üretimi, nörogenez ve nöron farklılaşması ile ilgili GO terimleri de gözlemlendi (GO:0048699, GO:0022008, GO:0030182). Bu durum, bu dönemde sinir kresti popülasyonlarının varlığını açıklayabilir ([16]). Ayrıca, daha genel gelişim ile ilgili GO terimleri de gözlemlendi, örneğin hücre gelişimi ve çok hücreli organizmanın düzenlenmesi (GO:0048468, GO:0051239).
( Şekil 1 – 8 ve 12 pkh İnsan Embriyonik Akciğerlerinde Gen Ekspresyon Analizi a)Hiyerarşik kümeleme analizi, gen ekspresyon modeline göre örneklerin nasıl gruplandığını gösterir.b) Temel bileşen analizi (PCA), örneklerin yaşa göre nasıl kümelendiğini gösterir.c) Isı haritası, 8 ila 12 pkh arasında diferansiyel olarak eksprese edilen 88 geni gösterir. IGFBP3 kırmızı ile işaretlenmiştir.d) STRING analizi, farklı genler arasındaki etkileşimleri gösterir.e) Gen Ontoloji (GO) zenginleştirme analizi, belirlenen genlerin en çok hangi biyolojik süreçlerle ilişkili olduğunu gösterir.f) Hiyerarşik kümeleme, dört farklı gen ekspresyon trendini gösterir.g) Seçilmiş genlerin (ETV5, HAND2, PRDM1, CD44, RSPO3, IGFBP3) ekspresyon analizleri, zaman içinde belirgin eğilimler gösterir. )
Genler bazında yapılan hiyerarşik kümeleme analizi 8 ile 9 gebelik haftası (pkh) arasından yetişkin döneme kadar farklı ekspresyon eğilimlerine sahip 4 küme belirlemiştir. Küme 1, 8–9 pkh’den 12 pkh’ye kadar ekspresyonu artan ancak yetişkin akciğer dokusunda azalan genleri içeriyordu; Küme 2, 8 pkh’den yetişkin döneme kadar ekspresyonu azalan genleri içeriyordu; Küme 3, 8–9 pkh’den yetişkin döneme kadar ekspresyonu artan genleri içeriyordu; son olarak, Küme 4, 8–9 pkh’den 12 pkh’ye kadar ekspresyonu azalan ancak yetişkin dokusunda artan genleri içeriyordu (Şekil 1F). Bu eğilimlerin psödoglandüler evre boyunca sürekli olduğunu doğrulamak için 10 ve 11 pkh’ye ait embriyonik örnekleri analize ekledik. Her kümeden birkaç gen seçtik ve bunları, 7–8 pkh’den 12 pkh’ye kadar her pkh’den en az 4 örnekte gerçek zamanlı PCR ile inceledik (7–8 pkh’den 4 örnek, 9 pkh’den 4 örnek, 10 pkh’den 5 örnek, 11 pkh’den 4 örnek ve 12 pkh’den 5 örnek insan akciğer embriyonik dokusu). Analiz için, her kümeden ilgi duyulan genleri seçtik: Küme 1'den ETV5; Küme 2'den HAND2; Küme 3'ten PRDM1 ve CD44; ve Küme 4'ten RSPO3 ve IGFBP3. Tüm genlerde, gelişimsel zamana göre ekspresyon seviyesinde doğrusal bir eğilim gözlemledik. ANOVA analizi, tüm genlerde farklı pkh'ler arasında anlamlı farklar olduğunu gösterdi (p≤0.05) (Şekil 1g). Daha ileri analiz için, IGFBP3 genine odaklanmaya karar verdik.
IGFBP3 protein ekspresyonu, epitele sınırlıydı.
7'den 12 pkh'ye kadar gelişim aşamasındaki akciğer kesitlerinde IGFBP3 protein ekspresyonunun immünofloresans analizi, protein ekspresyonunun epitele zenginleştiğini ve çevredeki mezenkimde belirgin şekilde azaldığını gösterdi (Şekil 2a). Özellikle, 8 ve 9 pkh örneklerinde IGFBP3 ekspresyonu epitele sınırlıydı ve çevredeki mezenkimde tespit edilmedi. IGFBP3 ve epitel belirteçi E-CAD'ın kollokalizasyonu, epitel ekspresyonunu doğruladı (Şekil 2b).
( Şekil 2. İnsan akciğer embriyonik ve fetüs dokularında IGFBP3'ün immünofloresans ile tespiti. a. 7'den 12 pkh'ye kadar insan embriyonik akciğerlerinde IGFBP3 protein ekspresyonu, epitel hücrelerinde tercihli ekspresyonu göstermektedir. b. 7–10 pkh akciğer embriyonik dokularında IGFBP3 ve E-CAD protein ekspresyonu, her iki markerın epitel hücrelerinde birlikte ekspresyonunu göstermektedir. )
Epitelyal ve mezenkimal zenginleştirilmiş popülasyonlarda IGFBP3 mRNA ekspresyonu
Epitel ve mezenkim arasındaki protein seviyesindeki gözlemlenen farkların, farklı kompartmanlar arasındaki mRNA ekspresyonundaki farklarla ilişkili olup olmadığını belirlemek için dokuyu dissosiasyon yaparak, EPCAM antikoru kullanarak epitel açısından zenginleştirilmiş popülasyonları (EPCAM+ popülasyonu) ve mezenkim açısından zenginleştirilmiş popülasyonları (EPCAM- popülasyonu) izole etmeye karar verdik ve IGFBP3 ekspresyonunu ayrı ayrıanaliz ettik. IGFBP3 protein seviyesindeki farklılıkları açıklayabilecek şekilde, her iki popülasyon arasında IGFBP3 mRNA seviyelerinde anlamlı bir fark gözlemleyemedik (Şekil 3a). Aslında, tüm akciğer dokusu analiz edildiğinde gözlemlendiği gibi (Şekil 1g) her iki popülasyonda da ekspresyonun 10 pkh'den 12 pkh'ye azaldığı görüldü (Şekil 3b). Bu sonuç epitel ve mezenkim arasındaki IGFBP3 protein ekspresyonundaki farklılıkları açıklamak için mikroRNA’lar gibi potansiyel post-transkripsiyonel bir düzenlemenin rol oynayabileceğini düşündürmektedir.
İnsan akciğer gelişiminin erken psödoglandüler evresinden geç evresine kadar farklı mikroRNA ekspresyonunun analizi
Psödoglandüler evredeki farklılaşma sürecinde rol oynayan mikroRNA’ları belirlemek için, daha önce mRNA profillemesi için kullanılan aynı örneklerde (n=6, Şekil 1) toplam 758 mikroRNA’nın ekspresyonunu analiz ettik. Farklı ekspresyon analizi, 8 ve 9 pkh örnekleri ile 12 pkh akciğer örnekleri arasında farklı şekilde eksprese edilen 10 mikroRNA belirledi (Şekil 3c ve Tablo S4). Farklı şekilde eksprese edilen mikroRNA’lar tarafından düzenlenen potansiyel yolları belirlemek için miRPath v2.0 kullanarak keşifsel bir analiz gerçekleştirdik. p ≤ 0.001 değerine sahip 21 KEGG yolu belirlendi ve bu yollarda birçok genin tespit edilen mikroRNA’ların potansiyel hedefleri olduğu görüldü (Şekil 3d ve Tablo S3). En anlamlı yol "ErbB sinyal yolakları" olup, bu yolakta 7 mikroRNA tarafından hedeflenen 24 gen bulunmaktaydı. Analizde belirlenen diğer önemli akciğer yolları arasında "PI3K-Akt sinyal yolu", "Wnt sinyal yolu", "TGF-beta sinyal yolu" ve "p53 sinyal yolu" yer almaktadır.
IGFBP3'ü düzenleyen mikroRNA'ların tanımlanması
IGFBP3'ü hedef alan potansiyel mikroRNA'ları belirlemek için, aynı embriyonik örnekte mikroRNA ekspresyonu ile farklı şekilde eksprese edilen genleri (DEG) regülatör mikroRNA (RmiR) programını kullanarak çapraz korelasyon yaptık. RmiR, hedef gen tahmin bilgilerini TargetScan'den (http://www.targetscan.org/) almaktadır. Bu analiz sonucunda, ters ekspresyon korelasyonu gösteren (minimum -0.4 olarak kabul edildi) ve TargetScan tarafından potansiyel adaylar olarak belirlenen birkaç gen-mikroRNA çifti tespit edildi: TNXB ve miR-148a (r=− 0.4154632); RSPO3 ve miR-16 (r=−0.4288525); PRDM1 ve miR-186 (r=− 0.6858153); RSPO3 ve miR-195 (r = − 0.6850341); HAND2 ve miR-25 (r=−0.4435238); ve en güçlü ters korelasyon ise IGFBP3 ve miR-34a arasında bulundu (r = − 0.7947488).
Şekil 3e'de, IGFBP3’ün 3'UTR bölgesi ve TargetScan 8.0 tarafından tahmin edilen korunmuş mikroRNA bağlanma bölgeleri gösterilmektedir. Bu bölgeler arasında, miR-34a da yer almakta olup, bu mikroRNA aynı zamanda 8–9 ve 12 pkh arasındaki akciğer gelişiminde farklı şekilde eksprese edilen mikroRNA’lardan biri olarak tespit edilmiştir. Psödoglandüler evrede miR-34a ve IGFBP3 arasındaki korelasyonu doğrulamak amacıyla, mevcut tüm embriyonik örneklerde (n = 20, Şekil 3f) tekli TaqMan testleri kullanılarak miR-34a ekspresyonu analiz ettik. miR-34a, 8 pkh’den 12 pkh’ye kadar akciğer gelişimi sürecinde kademeli olarak artan bir ekspresyon göstermektedir (ANOVA p = 0.0091). Ayrıca, tüm örneklerde yapılan korelasyon analizi, IGFBP3 ile miR-34a arasında negatif bir korelasyon olduğunu doğrulamıştır (r = -0.6826; p = 0.0009, Şekil 3g). Şekil 3h'de, IGFBP3'ün miR-34a ile ters bir ekspresyon modeli sergilediğini gözlemledik. Erken psödoglandüler evrede (8 pkh), IGFBP3 seviyesi en yüksek, miR-34a seviyesi ise en düşük düzeydedir. Geç psödoglandüler evrede (12 pkh) ise IGFBP3 seviyesi en düşük, miR-34a seviyesi ise en yüksek olmuştur. Ayrıca, 9, 10 ve 11 pkh süresince IGFBP3'ün kademeli olarak azaldığını (downregulation) ve miR-34a'nın giderek arttığını (upregulation) gözlemledik.
miR-34a mezenkimde yukarı regüle edilir
miR-34a’nın epitel zenginleştirilmiş popülasyon (EPCAM+) ve mezenkim (EPCAM-) zenginleştirilmişpopülasyonlardaki ekspresyonunu analiz ettiğimizde, EPCAM- hücrelerinde anlamlı derecede yukarı regüle olduğunu gözlemledik (p = 0.0047, Şekil 3i). Dikkat edilmesi gereken bir nokta, EPCAM- popülasyonundaki miR-34a ekspresyonunun 10 pkh’den 12 pkh’ye kadar arttığıdır (Şekil 3j). Bu eğilimi, daha önce tüm akciğer dokusu analiz edildiğinde de gözlemlemiştik. (Şekil 3f). Ancak, EPCAM+ popülasyonunda miR-34a ekspresyonu bu dönem boyunca düşük seviyelerde sabit kalmıştır.
miR-34a, akciğer embriyonik mezenkim hücrelerinde IGFBP3 translasyonunu inhibe etmektedir
miR-34a'nın IGFBP3 protein seviyelerini akciğer embriyonik mezenkim hücrelerinde düzenlediğini ve bu nedenle psödoglândüler evrede mezenkimal kompartmanda IGFBP3 protein ekspresyonunun eksikliğinden sorumlu olduğunu doğrulamak için, miR-34a seviyelerini inhibe edip IGFBP3 ekspresyonunu incelemek amacıyla primer akciğer embriyonik mezenkim hücrelerinde kültür yaptıktan sonra miR-34a inhibisyonu gerçekleştirdik. miR-34a’yı antisens oligonükleotid (ASO) kullanarak inhibe ettik ve bu miR-34a ekspresyonunu ortalama %31 oranında azalttı (p = 0.0818, Şekil 4a), bu da miR-34a ASO ile transfüze edilmiş mezenkim hücrelerinde IGFBP3 mRNA seviyelerinde anlamlı bir artış ile ilişkiliydi (p = 0.0185, Şekil 4b). Bu sonuç, kontrol hücreleriyle karşılaştırıldığında, scrambled oligo ile transfüze edilen hücrelerde gözlemlenen artışa göre daha belirgindi. İlginç bir şekilde, mRNA seviyelerindeki bu artış, protein seviyelerinde de gözlemlendi. miR-34a'yı susturduğumuz mezenkim hücrelerinde protein seviyelerinde %30'luk bir artışgözlemlendi (Şekil 4c).
(Bir sonraki sayfada şekilleri inceleyiniz.)
Şekil 3. IGFBP3'ün mezenkimal kompartmanda miR-34a tarafından negatif düzenlendiğini gösteriyor. a. EPCAM+ (epitelyum açısından zenginleştirilmiş) ve EPCAM- (mezenkim açısından zenginleştirilmiş) saflaştırılmış hücrelerde IGFBP3 mRNA ekspresyonu analizi, her iki popülasyon arasında anlamlı bir fark göstermemektedir. b. EPCAM+ vs EPCAM- hücre popülasyonlarında pcw'ye göre IGFBP3 mRNA ekspresyonu, her iki hücre grubunda da IGFBP3 mRNA ekspresyonunun zamanla azaldığını göstermektedir. c. 8 ile 12 pcw arasında farklı şekilde ekspresyon gösteren 10 mikroRNA'nın ısı haritası. d. DIANA-miRPath v2.0 analizi (http://diana.imis.athena‐innovation.gr/DianaTools/index.php?r=mirpath/index) kullanılarak tespit edilen 10 farklı şekilde ekspresyon gösteren mikroRNA analiz edilmiştir. KEGG sinyal yolları, seçilen mikroRNA'lar tarafından hedeflenen gen sayısına göre sıralanmıştır. X ekseni, y ekseninde gösterilen her bir KEGG yolunda tanımlanan gen ve mikroRNA/hedef etkileşim analizinde tanımlanan mikroRNA sayısını göstermektedir. e. IGFBP3'ün 3'UTR bölgesinin şematik temsili ve buna hedef olan tahmin edilen korunmuş mikroRNA'lar, miR-34a da dahil, şeklin alt kısımda baz-baz eşleşmesi ile gösterilmiştir. f.Gerçek zamanlı PCR ile yapılan miR-34a ekspresyon analizi, 8 (n = 2), 9 (n = 4), 10 (n = 5), 11 (n = 4) ve 12 (n = 5) pcw insan akciğer embriyonik dokularından alınan örneklerde, miR-34a ekspresyonunun zamanla arttığını göstermektedir. g. Eşli örneklerde miR-34a ve IGFBP3 ekspresyonu arasındaki korelasyon analizi, her iki gen arasında anlamlı bir negatif korelasyon göstermektedir. h. IGFBP3 ve miR-34a'nın miktar ölçümleri, bu iki genin ters yönde bir ekspresyon paterni sergilediğini göstermektedir. IGFBP3 zamanla aşağıya düzenlenirken, miR-34a yukarıya düzenlenmektedir. i.miR-34a ekspresyon analizi, EPCAM+ ve EPCAM- saflaştırılmış hücrelerde, her iki popülasyon arasında anlamlı farklar göstermektedir. miR-34a, mezenkimal zenginleştirilmiş popülasyonda yukarıya düzenlenmiştir. j. miR-34a ekspresyonu pcw'ye göre EPCAM+ ve EPCAM- hücre popülasyonlarında, EPCAM- hücre grubunda miR-34a ekspresyonunun zamanla arttığını, ancak EPCAM+ grubunda miR-34a ekspresyonunun düşük seviyelerde sabit kaldığını göstermektedir.
(Şekil 4 – MiR-34a'nın Susturulması, Mezenkimal Hücrelerde IGFBP3 Ekspresyonunu artırır. a) MiR-34a ASO transfeksiyonu, miR-34a seviyelerini düşürdü.b) IGFBP3 mRNA seviyeleri, miR-34a ASO transfekte edilmiş hücrelerde arttı.c) Western blot analizleri, IGFBP3 proteininin miR-34a susturulmasıyla arttığını doğruladı.d) İmmünofloresan görüntülerde, IGFBP3’ün aktin ile kolokalize olduğu görüldü.)
IGFBP3'ün proksimal distal hava yolunda farklı ekspresyonu ve uçtan türetilen (tip-derived)organoidlerde aşırı ekspresyonu
Epitel hücrelerdeki IGFBP3 ekspresyonunun proksimal-distal paternde rol oynayıp oynamadığını incelemek amacıyla, bronş ağacının farklı yerlerindeki ekspresyonunu analiz etmeye karar verildi.
Bu amaçla, önce enzimatik olarak ve sonra mezenşimi manuel olarak ayırarak bronş ağacını izole ettik ve stereoskopik mikroskop altında çalışırken uçları ve sapları izole edildi. (Şekil 5a) Her iki izole edilmiş dokudan RNAsaflaştırılmasından sonra, proksimal embriyonik hava yolunda aşırı ifade edilen bir gen olan MUC5AC mRNA düzeylerinin analizi , MUC5AC'nin uç zenginleştirilmiş popülasyona kıyasla sapta önemli ölçüde aşırı ifade edilmesi nedeniyle zenginleştirilmiş popülasyonları doğru şekilde saflaştırdığımızı doğruladı (p <0,001, Şekil 5b). Her iki popülasyondaki IGFBP3 mRNA seviyelerinin analizi, uçlardaki distal epitel popülasyonunda bir up-regülasyongösterdi (p = 0,025, Şekil 5c). Ayrıca, miR-34a, uç popülasyonunda down-regülasyon ile ters bir ekspresyon gösterdi (p = 0,002, Şekil 5d). IGFBP3'ün uçtan türetilenorganoidlerdeki protein analizi, IGFBP3 proteininin uçtan türetilen organoidlerin epitel hücrelerinde yüksek oranda ekspresyonu nedeniyle, uç popülasyonunda IGFBP3'ün giderek arttığını protein düzeyinde doğruladı (Şekil 5e). E-kadherin, IGFBP3ün uçtan türetilen organoidlerdeki epitel hücrelerinde ekspresyonunu doğrulamak için epitel belirteci olarak kullanıldı.
(Şekil 5 – IGFBP3, Embriyonik Akciğer Uçlarında Eksprese Edilir ve Diferansiyasyonla kaybolur.a) Bronşiyal ağacın uç ve gövde bölgelerinin izolasyonu stereomikroskop altında gösterilmektedir.b) MUC5AC ekspresyonu, gövde bölgelerinde daha yüksek olduğunu doğrulamaktadır.c) IGFBP3 ekspresyonu, uç bölgelerde daha yüksektir.d) MiR-34a ekspresyonu, gövdeye kıyasla uç bölgelerde daha düşüktür.e) Tip-türevli organoidlerde IGFBP3 ve E-CAD ekspresyonu gösterilmektedir.f) Farklılaşmamış ve diferansiye olmuş organoidlerin morfolojisi karşılaştırılmıştır.g) MUC5AC ve IGFBP3 ekspresyonları, diferansiye organoidlerde analiz edilmiştir.h) MUC5AC ekspresyonu, diferansiye olmuş organoidlerde artmıştır.i) IGFBP3 ekspresyonu, diferansiyasyon sürecinde azalmaktadır.j) MiR-34a ekspresyonu, diferansiye olmuş organoidlerde artmıştır.k) Tek hücre RNA dizileme analizi, IGFBP3'ün alveolar diferansiyasyon sırasında azaldığını doğrulamaktadır. )
Organoid farklılaşması IGFBP3 ekspresyonunu önemli ölçüde azaltır
Psödoglandüler evrede meydana gelen dallanma morfogenezi sırasında oluşan farklılaşma süreci nedeniyle IGFBP3 ekspresyonunun kaybolup kaybolmadığını incelemek amacıyla, uçtan türetilen organoidleri farklılaştırıcı ortamda kültüre ederek proksimal hava yoluna farklılaştırmaya karar verildi. Farklılaşmış organoidler, silli ve goblet hücreleri gibi farklılaşmış hücrelerin görünümünden kaynaklanan morfolojik değişiklikler (Şekil 5f) kazanır. Goblet hücrelerinin varlığı, bu makalede organoid farklılaşma süreci için bir kontrol olarak kullanılan MUC5AC için organoidin lümeninde pozitif bir mukus birikimine neden olur. Böylece, hem MUC5AC protein ekspresyonunun (Şekil 5g) hem de mRNA ekspresyonunun (Şekil 5h) seviyelerinin kontrollerle karşılaştırıldığında farklılaşmış organoidlerde yükseldiği gözlemlendi. miR-34a farklılaşmamış kontrollere kıyasla farklılaşmış organoidlerde mRNA ekspresyonunun arttığınıgösterirken (Şekil 5j), kontrol ve farklılaşmış organoidlerdeki IGFBP3’ün analizi, farklılaşmış organoidlerin epitelindeki IGFBP3 seviyelerinde belirgin bir azalma olduğunu gösterdi (Şekil 5g, i).
Alveolar-farklılaşmış organoidlerin tek hücreli RNAseq analizi, IGFBP3 seviyelerinde önemli bir azalma gösterdi
[12]'den alınan scRNA verilerini kullanarak, uçtan türetilen organoidlerde ve alveolar-farklılaştırılmış organoidlerde IGFBP3 ekspresyonunu analiz ettik. Önceki sonuçlarımızı doğrulayarak, IGFBP3 ekspresyonunun organoid farklılaşmasından sonra büyük ölçüde azaldığını gözlemledik (Şekil 5k–m). Kontrol uçtan türetilen organoidlerde, IGFBP3 ekspresyonu çoğunlukla uç hücrelerinde lokalize oluyordu. Ek olarak, bazal hücre benzeri hücrelerde bazıyüksek IGFBP3 ekspresyonu gözlemlendi. Farklılaşmadan sonra, alveolar-farklılaşmış organoidin birkaç dispers hücresi, IGFBP3'ü düşükseviyelerde eksprese etti ve sinyal, hücre hattı negatif (Lin_NEG) organoid hücre popülasyonunda yoğunlaştı (Şekil 5l, m).
IGFBP3 susturulması organoidlerde alveolar farklılaşmayı indükler
IGFBP3'ün farklılaşmadan sonrakı kaybını gösteren önceki gözleme dayanarak, farklılaşma sürecindeki rolünüdeğerlendirmeyi amaçlandı. Nükleofeksiyon teknolojisi ve DsiRNA'ları kullanarak 12 pkh uçtan türetilen organoidlerde IGFBP3 ekspresyonunu inhibe edildi (Şekil 6a). Transfeksiyondan sonra her 5 saatte bir kare yakalayan 48 saatlik zaman atlamalı çalışma, IGFBP3'ün susturduğu organoidlerin alveoler benzeri yapılarda farklılaşmaya başladığını gösterdi (Şekil 6b). Şekil 6c'de, alveol kürelerine benzeyen uç kaynaklı organoidlerde IGFBP3 susturulmasından 48 saat sonra elde edilen alveoler benzeri yapılar görülebilir. IGFBP3’ün susturulmasından sonra oluşan moleküler değişiklikleri incelemek için altı kök hücre belirtecinin ve dokuz alveolar belirtecinin ekspresyonunu analiz edildi. Kontrol organoidleriyle karşılaştırıldığında, IGFBP3 susturulmuş organoidler, OCT4, KLF4, NANOG ve ALDH1A3 (Şekil 6d) dahil olmak üzere kök hücre belirteçlerinde kademeli olarak azaldığını gösterdi; bu da gözlemlenen morfolojik değişiklikler doğrultusunda kök hücre potansiyelinin kaybını ve farklılaşmayı gösterir. İlginç bir şekilde, alveolar tip 2 (AT2) hücre belirteci SFTPC ve LAMP3'ün (Şekil 6e) giderek artması alveolar farklılaşmayı belirtmektedir. Önemli olmasa da, diğer AT2 (Şekil 6e) ve alveolar tip 1 (AT1) (Şekil 6f) hücre belirteçleri de IGFBP3 susturulmasından 48 saat sonra kademeli arttığını gösterdi. Kontrol ve susturulmuş organoidlerdeki SFTPC'nin immünofloresan analizi, IGFBP3 susturulmuş organoidlerde AT2 belirteci SFTPC'nin aşırı ekspresyonunu doğruladı (Şekil 6g).
Yüksek IGFBP3 seviyeleri akciğer eksplantlarında farklılaşma sürecini yavaşlatır
IGFBP3 peptidi ile 48 saat boyunca kültüre edilen 10 pkh embriyolarından elde edilen akciğer eksplantları, kontrol eksplantlarına kıyasla belirgin bir epitel morfolojiye sahipti (Şekil 6h). Histolojik analizde (hematoksilin boyama), kontrol eksplantlarında 48 saatlik kültürden sonra daha kübik bir epitel gözlemlenirken, IGFBP3 eksplantları daha önceki bir adımda kalarak henüz kübik bir endodermik epitele farklılaşmasını tamamlamamış daha psödostratifiye bir epitel gösterdi.
IGFBP3 susturulması TGFβ inhibisyonunu ve BMP aktivasyonunu indükler
IGFBP3 aracılı alveoler farklılaşmayı kontrol eden sinyal olaylarını anlamak için, IGFBP3 ile etkileşime girdiği açıklanan çeşitli farklılaşma süreçlerinde yer alan temel bir yol olan TGFβ sinyal yoluyla ilişkili 8 fosforile proteinin seviyelerini profillemeye karar verildi [33, 34]. Uçtan türetilen organoidlerde IGFBP3'ün susturulmasından yirmi dört saat sonra, p-SMAD2'nin kademeli olarak azalamasıyla (p = 0,0001) gösterilen TGFβ sinyallemesinde inhibisyon ve p-SMAD1'in giderek arttığını (p = 0,0197) gösteren BMP sinyallemesinde bir artış gözlemlendi. Önemli olmasa da p-ATF2 (p = 0,0793), p-c-Fos (p = 0,0692) ve p-c-Jun (p = 0,1441)'da da artış regülasyonu oluyor. Ek olarak, p-SMAD5'in de azalma regülasyonu kaydedildi (p = 0,0203) (Şekil 6i, j). İlginçtir ki, p-SMAD2'nin azalma regülasyonu, SOX2, OCT4 ve NANOG dahil olmak üzere daha önce tanımlanmış transkripsiyonel olarak aktive edilmiş hedef genlerin azalma regülasyonu ile ilişkilidir (Şekil 6d, k). Ayrıca, p-SMAD'nin up-regülasyonu, SFTPB, SFTPC ve SFTPD dahil olmak üzere aktive edilmiş hedef genlerin artış regülasyonu ile ilişkilidir (Şekil 6e, k), bu da IGFBP3 susturulmasının TGFβ ve BMP sinyallemesinin kademeli artması ve azalmasındaki fonksiyonel etkisini doğrulamaktadır (Şekil 6k).
Şekil 6 – IGFBP3 Susturulması, Alveolar Diferansiyasyonu indükler.a) IGFBP3 ekspresyonu, siRNA ile susturulmuştur.b) IGFBP3 susturulmuş organoidlerde zaman içinde alveolar benzeri yapılara dönüşüm gözlemlenmiştir.c) 48 saat sonra IGFBP3 susturulmuş organoidlerin alveolar-like morfolojisi gösterilmiştir.d) Kök hücre belirteçleri IGFBP3 susturulmasıyla azalmaktadır.e) AT2 hücre belirteçleri (SFTPC, LAMP3) artmaktadır.f) AT1 hücre belirteçleri (AGER, HOPX) hafifçe artmaktadır.g) İmmünofloresan analizleri, IGFBP3 susturulmuş organoidlerde SFTPC ekspresyonunu göstermektedir.h) IGFBP3 ile kültüre edilen akciğer eksplantlarında farklılaşma gecikmiştir.i) Protein dizileri, IGFBP3 susturulmasıyla p-SMAD2’nin azaldığını ve p-SMAD1’in arttığını göstermektedir.j) TGFβ ve BMP yolaklarının protein ekspresyon değişimleri gösterilmiştir.k) IGFBP3 susturulmasının TGFβ/BMP sinyal dengesi üzerindeki etkileri şematik olarak gösterilmiştir.
